Name: רעילות נייד של Nanogenomedicine בקו MCF-7 נייד: assay MTT (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-04-03T00:00:00.000+00:00
Duration: 19 min 34 s
Description: למדו להעריך רעילות תאית של ננו-תרופות גנטיות בקו תאי MCF-7 באמצעות שיטת MTT. פרוטוקול זה מספק הדרכה שלב אחר שלב לבדיקת חיוניות תאים מבוססת פעילות מיטוכונדריאלית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצים להכיר לתאי גזע טכנולוגיה שהיד גאזי חברות טבריז בהתאמה למתן DMEM ללא מים סטריליים פנול אדום להזרקה כמתנות.

MCF-7 זריעת בצלחת-96 היטב: MCF-7 התאים בתרבית 25 t-בקבוק במדיום המכיל בינוני השתנה Dulbecco של הנשר (DMEM), 10% FBS, 100 U / ml פניצילין, ו -100 מיקרוגרם / מ&quot;ל סטרפטומיצין ב 37 ° C עם 5% CO 2, 95% האוויר והלחות להשלים. הגיעה לאחר ~ 90% confluency, הם היו מנותקים באמצעות 0.05% טריפסין / EDTA וספר באמצעות trypan כחול hemocytometer. תאים אלה היו resuspended אז בריכוז של 4 × 4 תאים 10 / 2 ס&quot;מ והוסיף לצלחת 96-היטב (כלומר, 250 μl / טוב) על ידי פיפטה 8 ערוצים. עבור קליטה רקע, בארות חלקם נשארו בתא חינם, כלומר כביקורת ריק. טיפול בתאי עם nanopolyplexes שונים: ב 40-50% confluency (48 שעות זריעת פוסט), התאים מעובדים טופלו nanostructured polyamidoamine dendrimers מהספרים (כלומר, Superfect Polyfect ® ו ®) ו פולימר מבחן הרומן בעקבות הוראה transfection שמספק לו הספק. תאים שטופלו גם עם EGFR ו מקושקשות antisense לבד, עם שלוש nanopolyplexes שונים של שני אלה oligonucleotides ועם פולימרים (n = 4). ארבע בארות היו נשאר לא מטופל כמו שליטה. לאחר 4 שעות בתקשורת טיפול הוסרו מתחדש עם מדיה חדשה. MTT assay להערכת כדאיות התא: Assay MTT בוצעה 24 שעות לאחר transfection. למטרה זו, הפתרון MTT הוכן 1mg/ml ב PBS והיה מסונן באמצעות מסנן 0.2 מיקרומטר. ואז, 50 μl של MTT בתוספת 200 μl של DMEM ללא פנול אדום נוספו לתוך הבאר כל, מלבד התא ללא בארות ריק. התאים הודגרו במשך 4 שעות ב 37 ° C עם 5% CO 2, 95% אוויר ולחות מוחלטת. לאחר 4 שעות, הפתרון MTT הוסרה והוחלפה 200 μl של DMSO ו גליצין 25μl סורנסון של המאגר (גליצין 0.1M, 0.1M NaCl, pH: 10.5 עם 0.1 NaOH). צלחת הודגר עוד 5 דקות בטמפרטורת החדר, ואת צפיפות אופטית (OD) של בארות נקבע באמצעות קורא צלחת באורך גל של 570 ננומטר הבדיקה ואת אורך גל של 630 ננומטר התייחסות.

<ol><li>Plumb, J. A., Milroy, R., Kaye, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+pH+Dependence+of+3-%284%2C5-Dimethylthiazol-2-yl%29-2%2C5-diphenyltetrazolium+Bromide-Formazan+Absorption+on+Chemosensitivity+Determined+by+a+Novel+Tetrazolium-based+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Effects of the pH Dependence of 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium Bromide-Formazan Absorption on Chemosensitivity Determined by a Novel Tetrazolium-based Assay.</a> Cancer Research. 49, 4435-4435 (1989).</li>
<li>Mosmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Colorimetric+Assay+for+Cellular+Growth+and+Survival%3A+Application+to+Proliferation+and+Cytotoxicity+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lmmunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival: Application to Proliferation and Cytotoxicity Assays.</a> Journal of Lmmunological Methods. 65, 55-55 (1983).</li>
<li>Yang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+and+Redox+States+in+the+C6+Glioma+Cells+Following+Acute+Exposure+to+Zn%2C+Se+%2B4+%2C+and+Se+%2B6+and+the+Correlation+with+Apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Mechanisms+and+Methods%22%5BJournal%5D)">Energy and Redox States in the C6 Glioma Cells Following Acute Exposure to Zn, Se +4 , and Se +6 and the Correlation with Apoptosis.</a> Toxicology Mechanisms and Methods. 16 (1), 13-13 (2006).</li>
<li>Spinner, D. M. MTT Growth Assays in Ovarian Cancer, in Ovarian Cancer: Methods and Protocols. Bartlett, J. M. S. , Humana Press, Inc. 175-177 (2000).</li>
</ol>

Assay MTT נחשבת שיטה צדדי ובהתאם את יכולת הקיום של תאים יכול להיות מוערך על טיפולים שונים. הפקת formazan כתוצאה שנראה יחסית ברמה של מטבוליזם האנרגיה בתאים. לכן, ניתן למדוד את התאים מופעל מטבולית גם בהעדר התפשטות תאים. כמות formazan המיוצר הוא יחסי לכמות MTT במדיום הדגירה. אמנם, את הריכוז של MTT אשר נדרש כדי להשיג את הסכום המקסימלי של formazan מיוצר עשוי להשתנות על ניצול של שורות תאים שונות. חוץ מזה, שיש בשימוש זה assay, מספר קטן מאוד של תאים חיים ניתן היה לזהות את השכיחות של טעויו...

<table><tbody><tr><td>בקבוק תרבית (T-flask) בנפח 25 מ"ל</td><td>Orange Scientific</td><td>5510100</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3813</td><td></td></tr><tr><td>דולבקו&amp;rsquo;מדיום Eagle משונה&amp;rsquo;מצע - גלוקוז גבוה</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5671</td><td></td></tr><tr><td>MTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2128</td><td></td></tr><tr><td>סרום עגל רב-ערכי (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין 200,000 u/ml</td><td>CinnaGen</td><td>CR7913</td><td></td></tr><tr><td>סטרפטומייצין 200 מ"ג/מ"ל</td><td>CinnaGen</td><td>CR7912</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין/EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3924</td><td></td></tr><tr><td>טריפאן בלו</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>סופרפקט</td><td>Qiagen</td><td>301105</td><td></td></tr><tr><td>Polyfect</td><td>Qiagen</td><td>301305</td><td></td></tr><tr><td>אנטיסנס ל-EGFR</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אנטיסנס מסובב (Scrambled antisense)</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM ללא פנול אדום</td><td>GIBCO, מבית Life Technologies</td><td>11880</td><td></td></tr><tr><td>גליצין</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>המציטומטר</td><td>HBG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פיפטה בעלת 8 ערוצים</td><td>TreffLab Transferpette</td><td>96.9918.10.1</td><td></td></tr><tr><td>מסנן מזרקים חד-פעמי </td><td>Iwaki, Asahi Techno Glass Corp.</td><td>2052-025</td><td></td></tr><tr><td>קורא לוחות המצויד ב-570 nm &amp;מסננים של 630 ננומטר </td><td>BioTek</td><td>ELX808</td><td></td></tr><tr><td>פלטה בעלת 96 בארות עם מכסה (תחתית שטוחה)</td><td>Iwaki, Asahi Techno Glass Corp.</td><td>3860-096</td><td></td></tr><tr><td>מapay flow hood (מנדף זרימה למינרית)</td><td>Esco Products</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פחמן חד-חמצני&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; אינקובטור</td><td>ASTEC</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

רעילות נייד של nanogenomedicine בקו mcf-7 נייד: assay mtt

Cellular Toxicity of Nanogenomedicine in MCF-7 Cell Line: MTT assay

Cytotoxicity של nanogenomedicine עתידני (למשל, התערבות RNA קצר antisense) עלול לעכב את הפיתוח הקליני שלה. מבין אלה, את התרופה גן מבוססי ו / או הספק שלו עלולים לעורר רעילות הסלולר. להערכת cytotoxicity כאלה, מתודולוגיה נפוצה היא תלויה במידה רבה על ניצול של 3 - (4, 5-dimethyl-2-thiazolyl) -2, 5-diphenyl-2H-tetrazolium ברומיד (MTT) assay אשר כבר בשימוש נרחב כמו גישה colorimetric מבוסס על פעילות של אנזימים דהידרוגנז המיטוכונדריה בתאים. בחקירה הנוכחית, MCF-7 תאים היו מחוסן בצלחת-96 היטב על 50% confluency הם טופלו nanopolyplexes שונים נתון MTT assay לאחר 24 שעות. MTT מסיס במים צהוב עובר מטבוליזם על ידי תאים פעילים מבחינה מטבולית למים מסיסים סגול formazan, אשר מומס נוספת pH חיץ dimethylsulfoxide ו s Sornson 10.5. המוצר כתוצאה ניתן לכמת ידי לספקטרופוטומטריה באמצעות קורא צלחת ב 570 ננומטר.

Assay MTT היא assay colorimetric קל לשעתקו להערכת כדאיות התא המבוסס על הפחתה של MTT צהוב וייצור של formazan מסיס במים סגול. כאן, לקיומה של MCF-7 תאים על הטיפול nanogenomedicine הוערך.

רעילות נייד של Nanogenomedicine בקו MCF-7 נייד: assay MTT

ציטוטוקסיות של ננו-גנומדיצינה עתידית (למשל, RNA מפריע קצר ואנטיסנס) עלולה לעכב את פיתוחה הקליני. מבין אלה, הגישות מבוססות הגנים...

שלום, אני Samaya Mad ממרכז למחקר רוקחותי וטכנולוגי. היום נרצה להראות לכם כיצד להשתמש במבחן כדי להעריך את חיוניות התאים לאחר חשיפתם לפלקסים שונים. בואו נתחיל.ראשית, אני מסיר את המצע. לאחר מכן אני שוטף את התאים ב-PBS. אך לפני כן, אני מחליף כפפות כדי למנוע זיהום של ה-PBS.כעת, לאחר השטיפות החדשות, אני מאחלה את התאים, מערבבת בעדינות ומסירה את ה-PBS לחלוטין. אני משתמשת ב-PPA קטן יותר. אני מוסיפה מספר מיקרוליטרים של trips.צוות, ודאו שכל התאים מכוסים בתמיסת הניתוק. כעת אני מקיש על הבקבוק. פעולה זו מסייעת לניתוק מלא של התאים.כעת ניתן לראות כי התאים התנתקו תחת מיקרוסקופ הפוך. אני מוסיף מצע כדי לעצור את פעילות ה-trypsin. לאחר מכן, אני רוצה לוודא שכל התאים התנתקו.כעת אני מעביר את התאים למבחנה מסוג Falcon 2. שוב, באמצעות פיפטינג, אני רוצה לוודא שיש לי תרחיף תאים הומוגני. אני מעביר כ-500 µL של תרחיף תאים למבחנת Eppendorf.לאחר מכן אני לוקח כ-50 µL מתליהי התאים למיקרו-מבחנה אחרת, מוסיף נפח זהה של trypan blue ומערבב. כדי לספור את התאים, אני זקוק תחילה להמוצימטר. אני מטפטף מספר טיפות מים כאן וכאן, ומניח בעדינות זכוכית כיסוי אחת על השקופית הזו. אני מערבב את הדגימה באופן מלא ממש לפני הספירה, ובהתאם לפרטי הדגימה, אני מעביר 7 µL מתליהי התאים אל תא הספירה.הקפידו לא להעמיס יתר על המידה. אני שואב את תרחיף

cellular-toxicity-of-nanogenomedicine-in-mcf-7-cell-line-mtt-assay

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

יש לנו מסונתז אנלוגי הרומן של pancratistatin עם פעילות נוגדת סרטן דומה כמו pancratistatin יליד; מעניין, טיפול הקומבינטורית עם טמוקסיפן הניב שיפור דרסטי אינדוקציה אפופטוטיים ו autophagic ידי המיטוכונדריה מיקוד עם השפעה מזערית על fibroblasts סרטני. לכן, JCTH-4 בשילוב עם טמוקסיפן יכול לספק טיפול בטוח נגד סרטן.

שיפור האינדוקציה אפופטוטיים, Autophagic ידי אנלוגי רומן סינתטי C-1 של deoxypancratistatin-7 ב אדנוקרצינומה השד האדם תאים neuroblastoma עם טמוקסיפן

תרכובות טיפוליות לעתים קרובות נבחנות ראשון במבחנה עם מבחני כדאיות. ספירת תאים עיוורת על ידי צופה אנושי יכולה להיות רגישה מאוד לשינויים קטנים במספר תאים, אבל לא להעריך את התפקוד. מבחני כדאיות ממוחשבים, כפי שמתואר כאן, יכולים להעריך גם מבנה ותפקוד באופן אובייקטיבי.

מבחני כדאיות לתאים בתרבית

שיטה לסינתזה של סוכני טיטניום ונדיום נגד סרטן אוויר רגיש מתוארת, יחד עם ההערכה של הפעילות ציטוטוקסיות כלפי שורת תאי הסרטן אנושית על ידי assay MTT.

מכלולים נגד סרטן מתכת: סינתזה וCytotoxicity הערכה על ידי assay MTT

מבחני נוירוטוקסיות משופרים במבחנה יסייעו בזיהוי תרכובות נוירו-פרוטקטיביות חדשות. התועלת של מנתח תאים מבוסס עכבה בזמן אמת לקביעת ציטוטוקסיות והגנה ציטולוגית בקווי תאים עצביים ולתיחום המעורבות של מסלולי שליח שני, ובכך להשיג תובנה במנגנון ההגנה העצבית.

Analyzer הנייד מבוססת עכבה בזמן אמת ככלי להתוות מסלולים מולקולריים מעורבים ברעילות העצבית וneuroprotection בקו תאים עצבי

מקרופאגים בכבד, הנקראים תאי קופפר, אחראים ללכידת ננו-חלקיקים במחזור הדם. אנו מתארים כאן שיטה, של טוהר תאים ותפוקה גבוהים, לבידוד תאי קופפר. בדיקת ה-LDH המותאמת משמשת כאן למדידת הרעילות הנגרמת על ידי ננו-צינורות פחמן בתאי קופפר.

בידוד תא Kupffer לNanoparticle בדיקת רעילות

הבחנה בשיטת החוץ הגופית היא שיטה מבוססת היטב להערכת הרעילות והרעלת הציטוזה, אך הבקיע את השימוש במיקרוסקופיה ידנית, הוא מפרך וסובל מהבדלים בין השונות לבין השערים. מאמר זה מתאר את הפרוטוקול שפותח כדי לבצע גרסה אוטומטית לחלוטין של השיטה באמצעות זרימת הדמיה רב ספקטנטרי.

שיטה אוטומטית לביצוע השימוש בשיטת ההדמיה באמצעות הדמיה רב ספקטקטרלית באמצעות זרימה

לעתים קרובות יש צורך להעריך את הרעילות הפוטנציאלית של מערכת תרכובות על תאים מתורבתים. כאן, אנו מתארים אסטרטגיה למסך מהימן עבור תרכובות רעילות בפורמט 96-היטב.

אסטרטגיה לזיהוי תרכובות המשפיעות על צמיחת תאים והישרדות בתאי מיונקים מתורבתים בתפוקה נמוכה לבינונית

הליך זה הוקם כדי לשמש לפיתוח תרבויות חזה 3D מתקדמות במבחנה, אשר יכול לספק הערכה רלוונטית יותר מבחינה פיזיולוגית של הסיכונים genotoxic הקשורים חשיפות ננו חומריים על פני משטרי מינון חריפה או ארוכת טווח, חוזרים ונשנים.

דגמי כבד תלת-ממדיים מתקדמים לבדיקות גנוטוקסיות במבחנה בעקבות חשיפה ננו-חומרית לטווח ארוך

הפרוטוקול מתאר תפוקה מהירה, גבוהה, אמינה, זולה, ובלתי משוחדת, לקביעת יעילות של הכדאיות הסלולרית. תסה זו שימושית במיוחד כאשר המיטוכונדריה של התאים נפגעה, מה שמפריע לאסות אחרות. ההסתה משתמשת בספירה אוטומטית של תאים המוכתמים בשני צבעים גרעיניים – Hoechst 33342 ו-propidium iodide.

תסיסה אוטומטית של כתמים גרעיניים דיפרנציאליים לקביעה מדויקת של ציטוקוקסיות מיטוקאן

פרוטוקול זה מציג מבחני ציטוטוקסיות נפוצים (Alamar Blue [AB], CFDA-AM, Neutral Red ו-MTT assays) המותאמים להערכת ציטוטוקסיות בעוברים של דגי זברה (ZEM2S) ובקווי תאי כבד (ZFL) בלוחות של 96 בארות.

בדיקות ציטוטוקסיות עם קווי תאים של דגי זברה

המחקר הבא מעריך את הפרופיל הטוקסיקולוגי של מסגרת מתכתית-אורגנית נבחרת המשתמשת בחישת עכבת תא חשמלי (ECIS), טכניקת סינון בזמן אמת ובתפוקה גבוהה.

חישת מצע תא חשמלי להערכה בזמן אמת של פרופילים טוקסיקולוגיים של מסגרת מתכת-אורגנית

למדו להעריך רעילות תאית של ננו-תרופות גנטיות בקו תאי MCF-7 באמצעות שיטת MTT. פרוטוקול זה מספק הדרכה שלב אחר שלב לבדיקת חיוניות תאים מבוססת פעילות מיטוכונדריאלית.

רעילות נייד של Nanogenomedicine בקו MCF-7 נייד: assay MTT

גלה סרטונים נוספים