Name: Derivazione di cellule staminali ematopoietiche da cellule staminali embrionali murini (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-02-25T00:00:00.000+00:00
Duration: 22 min 6 s
Description: Scopri come derivare cellule staminali ematopoietiche trapiantabili da cellule staminali embrionali murine. Questo protocollo utilizza corpi embrionali e HoxB4 per generare una popolazione cellulare in grado di salvare topi irradiati.

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Differenziazione delle cellule staminali embrionali <ol><li> Raccogliere un pallone vicino confluenti di cellule staminali embrionali (ESC) tramite trattamento con tripsina ESC. </li><li> Risospendere le cellule in 5 ml di mezzi di differenziazione e trasferimento in un non-gelatina rivestito T25. Incubare a 37 ° C per 45 minuti. Recuperare il surnatante e raccogliere le cellule tramite centrifugazione. Nota: fibroblasti embrionali di topo (MEF) dalle culture CES collegare facilmente al non-gelatina rivestito T25 e quindi sono esaurite dalla cultura in questa fase placcatura. Se non sei coltura tuo ESC MEF, è possibile saltare il pre-piastra. </li><li> Risospendere MEF-CES impoverito nei media differenziazione a 333.333 cells/50 ml. Questa concentrazione si traduce in 100 ESC/15 ml. </li><li> Utilizzando pipettatore multicanale, piastra CES a 100 mL cells/15 caduta il 15 cm 2 piastre Petri. Con una pipetta a 8 canali, si dovrebbe essere in grado di adattarsi circa 18-22 righe di gocce al piatto (circa 5 ml per piastra). Nota: per questo protocollo, 2-5 15 cm 2 piatti di gocce sarà più che sufficiente e deve cedere 2-5 x 10 6 sei giorni EB cellule derivate. </li><li> Delicatamente capovolgere le piastre per invertire gocce. Incubare a 37 ° C 5% CO 2 per 48 ore. </li><li> Piscina scende di rimestando delicatamente piatti e trasferimento a 15 ml tubo conico. Lavare piatti con 4-6 ml di PBS e aggiungere 15 ml conica stessa. Nota: è possibile piscina fino a cinque piatti goccia pendente. L&#39;EBS crescerà che continuano a differenziare e se sono troppo concentrati tendono a formare grumi di grandi dimensioni. </li><li> Lasciare in pool EB di risolvere per gravità (circa 10 minuti). Aspirare il surnatante senza disturbare EBS. Risospendere delicatamente in media 10 ml Differenziazione e trasferimento a 10 cm non aderente piastra di Petri. </li><li> Inserire la piastra di Petri con agitazione a 50 rpm e incubare a 37 ° C al 5% di CO 2. </li><li> 24 ore più tardi (quattro giorni di differenziazione), piatti vortice di concentrarsi EB nel centro della capsula di Petri. Accuratamente lo scambio del 50% di media (5 ml) con 5 supporti mL Differenziazione fresca. Ritorna alla piastra incubatore per altri due giorni. </li></ol> EB dissociazione e l&#39;infezione con MSCV-HoxB4-IRES-GFP <ol><li> Il giorno sei di differenziazione, il trasferimento di EB a 15 ml tubo conico. Lasciar riposare per gravità. </li><li> Aspirare media e risospendere in 10 ml di PBS. Lasciare EBS per reinsediare per gravità. Aspirare il PBS. </li><li> Aggiungere 250 ml di miscela di enzimi dissociazione e 1 ml di PBS. Incubare a 37 ° C acqua bagno per 20 minuti, a volte vorticoso tubo di mescolare enzimi e EBS. </li><li> Aggiungere 8 ml di enzima senza buffer di dissociazione. </li><li> Triturare miscela utilizzando pipetta da 5 ml fino EB sono completamente dissociati (circa 10 volte; pipettaggio eccessiva aumenterà la morte entro il EB-derivati ​​preparazione delle cellule). <ol><li> Miscela diventerà nuvoloso con cellule come EB dissociano. </li><li> Posizionamento puntale contro la parte inferiore del tubo conico durante la triturazione creerà una forza di taglio che agevolerà notevolmente dissociazione. </li></ol></li><li> Raccogliere le cellule mediante centrifugazione. </li><li> Risospendere EB cellule derivate in 5 ml di 10% IMDM e contare con esclusione blu trypan Nota: Tra quattro giorni e sei giorni di differenziazione, EBS cavitazione che si traduce in una grande quantità di apoptosi e death.Thus cellulare, a sei giorni, verso l&#39;alto di 30% di EB cellule derivate possono macchiare con trypan blu. </li><li> Risospendere le cellule EB-derivati ​​a 100.000 cellule / 2 ml di 10% + IMDM virale surnatante tale che un MOI di 5-10 è achieved.Add solfato di protamina per una concentrazione finale di 8 mg / mL. Nota: Preparare EB abbastanza / virale mix surnatante alla piastra quattro piastre 6-bene (assumendo 2 ml / pozzetto). </li><li> Tavola 2 ml EB / virale mix surnatante per pozzetto di quattro 6 piatti ben pre-placcato con OP9 cellule stroma (vedi sotto). </li><li> Centrifugare piastre a 2500 rpm a temperatura ambiente per 90 minuti. Trasferire le piastre a incubatore a 37 ° C al 5% di CO 2. </li><li> 4-6 ore più tardi, raccolta surnatante dai piatti e raccogliere tutte le cellule potenziale residuo in sospensione tramite centrifugazione. </li><li> Risospendere il pellet (può essere di piccole dimensioni) in 48 mL IMDM 10% + citochine. Dispensare 2 ml / pozzetto di risospensione di originale in quattro a 6 pozzetti in cui è stata effettuata l&#39;infezione ed un surnatante è stato raccolto. Nota: Sempre preparare 10% IMDM + citochine fresco al momento dell&#39;uso. </li><li> Incubare le piastre a 37 ° C al 5% di CO 2 per sette giorni. Colonie dovrebbe essere evidente da quattro giorni dopo l&#39;infezione e di grandi dimensioni e ben formato da sette giorni. Una vigorosa espansione dovrebbe produrre 40-60 colonie / e il giorno sette. </li><li> Su sette giorni dopo l&#39;infezione, raccogliere e piscina tutte le cellule (comprese OP9 stroma) da tutti i pozzetti di trattamento con tripsina. Nota: NON surnatante o PBS lava impiegati durante tripsina treatment.At questo punto della cultura, alcune colonie possono essere solo vagamente aderente e ci sono molte cellule floaTing in suspension.Collect e piscina tutti i lavaggi e surnatante per garantire che non le cellule potenzialmente preziose vengono scartati. </li><li> Risospendere le cellule in 8 IMDM mL fresco del 10% + citochine. Distribuire 2 ml / fiasco in quattro T75 fiaschi. Aggiungere ulteriori 13 ml + 10% citochine IMDM ad ogni pallone. Incubare a 37 ° C al 5% di CO 2 per tre giorni (un totale di dieci giorni dall&#39;infezione). </li></ol> Cultura e placcatura di OP9 stroma <ol><li> Mantenere OP9 stroma secondo protocolli standard nel 20% a-MEM. OP9 cellule cambierà proprietà quando cresciuto fino a confluenza. Dividi sempre al 80% confluenza a non più di 1:03 split. </li><li> 24 ore prima infezione di sei giorni EB cellule derivate con MSCV-HoxB4-IRES-GFP, piastra OP9 25.000 cellule / pozzetto di quattro-sei pozzetti nel 20% a-MEM. </li></ol> Raccolta, il frazionamento e il trapianto <ol><li> Raccogliere le cellule espanse su OP9 stroma per dieci giorni attraverso il trattamento con tripsina. Contare le celle. Nota: NON surnatante o PBS lava impiegata durante il trattamento con tripsina. A questo punto, nella cultura, alcune colonie possono essere solo vagamente aderente e ci sono molte cellule galleggianti in suspension.Collect e piscina tutti i lavaggi e surnatante per garantire che non le cellule potenzialmente preziose vengono scartati. Nota: Una buona espansione dovrebbe produrre tra i 40-50 x 10 6 cellule / originale a 6 pozzetti infetti, per un totale di 160-200 x 10 6 cellule. </li><li> Cellule possono essere frazionate tramite magnetico selezione tallone o FACS secondo tecniche standard, a questo punto nel protocollo. </li><li> Per il trapianto, le cellule fornire via retro-orbitale o iniezione vena della coda per Rag-2/gc destinatari carenti (peso compreso tra 15-22 grammi), sottoposti ad una dose di scissione di 9,25 Gy di irradiazione 2,5 ore. a parte. Nota: è fondamentale che il peso degli animali compresi tra 15-22 grammi al momento della irradiazione. Se sono più grandi di 22 grammi, 9,25 Gy non sarà sufficiente una dose di irradiazione per garantire la ablazione appropriati e le cellule non possono mediare salvataggio da irradiazione letale e / o innestare il comparto ematopoietico. Se il trapianto di grandi animali, la dose di irradiazione appropriati devono essere determinati sperimentalmente. </li><li> Una dose minima di 2-5 x 10 6 cellule / animale è tenuto a garantire soccorso da irradiazione letale. In caso di frazionamento delle cellule, iniettare 2-5 x 10 6 cellule equivalenti (ad esempio se la popolazione di interesse rappresenta il 10% del pool di cellule non frazionata, iniettare 2-5 x 10 5 cellule / animale). Nota: Se l&#39;iniezione&gt; 2 x 10 6 cellule, SEMPRE iniettare via vena della coda per evitare la formazione di teratoma in orbita, che possono risultare quando un numero elevato di cellule vengono consegnati retro-orbitali. </li><li> Mantenere Rag-2 - / - / gc - / - destinatari carente in gabbie in autoclave. A seconda della &quot;pulizia&quot; della struttura animale, post-trapianto gli animali possono richiedere la somministrazione di acqua acidificata o Trimethiprim-Sulfasoxazole (Septra) per le 5 settimane successive radiazioni letali. </li><li> Aspettatevi&gt; GFP 90% + ES-derivati ​​leucociti nel sangue periferico a 3 settimane dopo il trapianto. Attecchimento deve essere multi-lignaggio, anche se i linfociti sono noti al silenzio retrovirali HoxB4-IRES-GFP. </li></ol>

<table><tbody><tr><td>Topi C57Bl/6 deficienti per Rag-2/gamma-c</td><td>Animale</td><td>Taconic Farm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agitatore per piastre</td><td>Strumento</td><td>VWR international</td><td>33998-360</td><td>Agitatore orbitale di Ikaworks</td></tr><tr><td>Pipetta multicanale</td><td>Strumento</td><td>VWR international</td><td>15000-174</td><td>ePet di BioHit</td></tr><tr><td>Tripsina ES</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>15090-046</td><td>Tripsina 0,25% in PBS</td></tr><tr><td>Tripsina standard</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>25300-062</td><td>Tripsina-EDTA 0,05%</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Tampone</td><td>Invitrogen</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>Tampone di dissociazione senza enzimi</td><td>Tampone</td><td>Invitrogen</td><td>13151-014</td><td></td></tr><tr><td>Miscela enzimatica di dissociazione</td><td>Tampone</td><td>Invitrogen</td><td>17104-019</td><td>500 mg di Collagenasi IV</td></tr><tr><td>Ialuronidasi</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H2126</td><td>congelare in aliquote da 500 &amp;mu;L ed evitare cicli ripetuti di congelamento e scongelamento.</td></tr><tr><td>DNAasi</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4527</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>10-017CV</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di protamina</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3369</td><td>8 &amp;mu;g/mL</td></tr><tr><td>Mezzo di differenziamento EB</td><td>mezzo</td><td></td><td></td><td>Consultare la ricetta nel file Protocol.doc allegato</td></tr><tr><td>IMDM 10%</td><td>mezzo</td><td></td><td></td><td>Consultare la ricetta nel file Protocol.doc allegato</td></tr><tr><td>IMDM 10% + citochine</td><td>mezzo</td><td></td><td></td><td>Consultare la ricetta nel file Protocol.doc allegato</td></tr><tr><td>anti-MEM 20%</td><td></td><td></td><td></td><td>Consultare la ricetta nel file Protocol.doc allegato</td></tr></tbody></table>

derivazione di cellule staminali ematopoietiche da cellule staminali embrionali murini

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

Una cellula staminale è definito come una cella con la capacità di entrambe le auto-rinnovarsi e di generare più progenie differenziata. Le cellule staminali embrionali (ESC) sono derivate dalla blastocisti dell&#39;embrione precoce e sono pluripotenti in grado differenziativo. Il loro potenziale differenziativo vasta li ha resi oggetto di ricerche molto centrata sulla dedurre il modo di convincere loro di generare tipi di cellule clinicamente utili. La derivazione di successo di cellule staminali ematopoietiche (HSC) da topo CES è stato recentemente compiuto e possono essere visualizzati in questo protocollo video. HSC, probabilmente la popolazione di cellule clinicamente più sfruttati, sono usati per trattare una miriade di tumori ematopoietici e disturbi. Tuttavia, molti pazienti che potrebbero trarre beneficio dalla terapia HSC non hanno accesso ai donatori idonei. ESC potrebbe fornire una fonte alternativa di HSC per questi pazienti. Il seguente protocollo stabilisce una linea di base da cui ESC-HSC possono essere studiati e informare gli sforzi per isolare da HSC umane ESC. In questo protocollo, ESC si differenziano come corpi embrionali (EBS) per 6 giorni nel commercio sierici pre-screening per la differenziazione ottimale ematopoietiche. EBS sono dissociati e poi infettati con HoxB4 retrovirali. Infetti EB cellule derivate sono placcati in OP9 stroma, un stromali del midollo osseo linea cellulare deriva dalla calvaria di M-CSF-/ - topi, e co-coltura in presenza di ematopoiesi promuovere citochine per dieci giorni. Durante questo co-coltura, le cellule infette espandere notevolmente e si traducono nella generazione un pool eterogeneo di 100s di milioni di cellule. Queste cellule possono quindi essere utilizzati per topi salvataggio e ricostituire letale irradiati.

Questa dettagli del protocollo la derivazione di cellule staminali ematopoietiche trapiantabili da topo cellule staminali embrionali (ESC) e la loro successiva iniezione in topi irradiati letalmente destinatario. In breve, ESC si differenziano come corpi embrionali, che sono poi infettati con HoxB4 retrovirali e co-coltura con cellule stromali OP9 e citochine ematopoietiche.

Derivazione di cellule staminali ematopoietiche da cellule staminali embrionali murini

Una cellula staminale è definita come una cellula dotata della capacità sia di autorinnovarsi sia di generare molteplici progenie differenziate. Le cellule staminali embrionali (ESC) sono...

La prima cosa che facciamo è prendere una T 25 confluenta di umsl. Quindi la laverò con PBS e aggiungerò alcune gocce di TR, lasciando agire per alcuni minuti. Posso vedere che le cellule si stanno staccando dalla piastra. È praticamente pronta.Ok, ora procederò a raccogliere le cellule oculari trattate con tripsina e sarà utile agitare leggermente il contenitore per disperdere le cellule oculari trattate con tripsina, rompendo così le colonie cellulari, e quindi trasferirle sulla piastra UN. Questa rimarrà nell'incubatrice per circa 30-45 minuti. Ora centrifugerò semplicemente queste cellule per raccoglierle e provvederò a rimuovere il soprannatante.Quindi, tra qualche minuto ricostituirò il campione in modo da poter effettuare il conteggio. Ho ricostituito il campione, ora ho effettuato il conteggio ed estraggo un'aliquote che diluirò a 50 ml, ottenendo così la concentrazione appropriata per avere cento cellule per goccia, al fine di verificare che le cellule siano in buone condizioni. Ora abbiamo un serbatoio.Dare a questi un leggero movimento rotatorio ancora, quindi versarli nel nostro serbatoio. Ok, quindi è già programmato. Ecco fatto.Ora è piuttosto dritto. Giratelo e mette

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La capacità di cellule staminali embrionali umane per auto-rinnovarsi e differenziarsi in tutti i tipi di cellule del corpo suggerisce che essi sono molto promettenti per le applicazioni mediche e come strumento di ricerca per affrontare questioni fondamentali per lo sviluppo e la malattia. Qui, mettiamo a disposizione una concisa, passo-passo il protocollo per la derivazione di cellule staminali embrionali umane da embrioni da immunosurgical isolamento della massa cellulare interna.

Derivazione di cellule staminali embrionali umane da Immunosurgery

Un metodo per analizzare la distribuzione di progenitori midollari ematopoietiche citometria di flusso e per isolare in modo efficiente altamente purificate cellule staminali ematopoietiche (CSE) è descritto. La procedura di isolamento è essenzialmente basata su un arricchimento magnetico di c-kit + e le cellule di separazione delle cellule per purificare CSE per studi cellulari e molecolari.

L&#39;analisi fenotipica e l&#39;isolamento di murini cellule staminali ematopoietiche e Lineage-committed progenitori

La manipolazione dell'espressione genica temporale nelle cellule staminali embrionali (ESC) differenzianti può essere ottenuta utilizzando sistemi genici inducibili. Tuttavia, la generazione di queste linee cellulari è costosa e richiede tempo. Questo protocollo consente di ottenere una rapida espressione di un transgene in cellule derivate da ES in differenziazione e la successiva analisi della differenziazione ematopoietica a valle.

L&#39;infezione retrovirale di Murine staminali embrionali cellulari derivate Cellule embrionali di corpo per l&#39;analisi di differenziazione emopoietiche

In questo protocollo, verrà illustrata la derivazione di cellule progenitrici cardiache da cellule staminali embrionali sia di topo che umane. Una delle principali strategie di questo protocollo consiste nell'arricchire le cellule progenitrici cardiache con la citometria a flusso utilizzando reporter fluorescenti ingegnerizzati nelle linee di cellule staminali embrionali.

Derivazione di cellule cardiache progenitrici di cellule staminali embrionali

Le cellule staminali embrionali di topo possono essere differenziate in cellule T in vitro utilizzando il sistema di co-coltura OP9-DL1. Il successo di questa procedura richiede un'attenta attenzione alla manutenzione del reagente/cellula e ai passaggi chiave della tecnica. Qui discutiamo questi parametri critici e forniamo un protocollo dettagliato per incoraggiare l'adozione di questa tecnologia.

Derivazione di cellule T In Vitro Da cellule staminali embrionali di topo

Le cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (HSPC) derivano da (hemogenic) cellule endoteliali specializzate durante lo sviluppo, ma poco si sa circa il processo attraverso il quale alcune cellule endoteliali specificano a diventare la formazione del sangue. Dimostriamo un metodo basato citometria a flusso che permette l'isolamento simultaneo di cellule endoteliali hemogenic e HSPC da tessuti embrionali murine.

Isolamento di cellule murine embrionali Hemogenic endoteliali

Il protocollo qui descritto descrive in dettaglio l'induzione di un programma emogenico nei fibroblasti embrionali di topo attraverso la sovraespressione di un insieme minimo di fattori di trascrizione. Questa tecnologia può essere tradotta nel sistema umano per fornire piattaforme per studi futuri sull'emopoiesi, la malattia ematologica e il trapianto di cellule staminali ematopoietiche.

Riprogrammazione fibroblasti embrionali di topo con fattori di trascrizione per indurre un programma Hemogenic

Qui, presentiamo pluripotenti umane protocolli di coltura della cellula formativa (hPSC), utilizzata per differenziare hPSCs in CD34+ progenitori ematopoietici. Questo metodo utilizza la modifica di fase-specifici di Canonica WNT segnalazione per specificare le celle esclusivamente al programma ematopoietica sia definitiva o primitivo.

Regia di differenziazione dei progenitori ematopoietici primitivi e definitivo da cellule staminali pluripotenti umane

Questo articolo descrive un protocollo per derivare e cultura pluripotenti linee di cellule staminali da embrioni di topo allo stadio di blastocisti efficacemente.

Derivazione di linee di cellule staminali da embrioni di Preimplantation Mouse

Qui presentiamo la metodologia per l'analisi clonale di cellule staminali ematopoietiche precursori durante lo sviluppo embrionale murino. Combiniamo Indice ordinamento delle singole cellule della regione di aorta-gonade-Mesonefro embrionale con co-coltura delle cellule endoteliali e trapianto per caratterizzare le proprietà fenotipiche e potenziale di attecchimento dei precursori ematopoietici singoli.

Analisi clonale di cellule embrionali staminali ematopoietiche precursori utilizzando indice della singola cella ordinamento combinato con cellule endoteliali nicchia co-cultura

Presentato qui è un semplice protocollo per la differenziazione diretta delle cellule endoteliali emogeniche da cellule staminali pluripotenti umane in circa 1 settimana.

Differenziazione diretta di cellule endoteliali emogeniche da cellule staminali pluripotenti umane

Scopri come derivare cellule staminali ematopoietiche trapiantabili da cellule staminali embrionali murine. Questo protocollo utilizza corpi embrionali e HoxB4 per generare una popolazione cellulare in grado di salvare topi irradiati.

Derivazione di cellule staminali ematopoietiche da cellule staminali embrionali murini

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