Name: Una sola célula grabaciones de succión de los conos del ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-05T20:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 35 s
Description: Aprende a registrar respuestas de fotoreceptores cónicos individuales en ratón mediante electrodo de succión. Este método de electrofisiología permite estudiar la fisiología celular y las propiedades de adaptación de los conos en neurociencia visual.

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Apoyado por el Premio de Desarrollo Profesional de Investigación para Prevención de la Ceguera, NIH EY 019312, y subvención sin restricciones de Investigación para Prevención de la Ceguera y EY 02687 (Departamento de Oftalmología y Ciencias Visuales en la Universidad de Washington).

Hacer electrodos <ol><li> Hacer los electrodos de registro utilizando un extractor de micropipeta y pulir los electrodos con filamento de calefacción bajo el microscopio. Para la grabación del ratón cono de succión de una sola célula, el diámetro interior en la punta del electrodo es de unos 6.7 micras. </li><li> Preparar electrodos de referencia. Pesar 1% de agar en agua destilada. Derretir la solución de agar en un baño de agua caliente. Llenar las pipetas de vidrio (L = 100 mm, OD / ID = 1/0.75 mm) con 1% de agar con una jeringa. Solidificar el agar a temperatura ambiente durante 10 minutos. </li><li> Cortar las pipetas en dos mitades con un cuchillo de diamante. </li><li> Sumerja los electrodos de referencia en la solución de referencia por lo menos 24 horas a 4 ° C. </li></ol> Configuración del experimento <ol start="5"><li> Dark adaptar un ratón en una jaula de negro durante la noche. </li><li> Prepare una solución de 100 ml de referencia y una solución de perfusión L (ver abajo) y el filtro de la solución. </li><li> Disolver 0,1% de BSA y 10 mM de glucosa en 20 ml de solución de referencia. </li><li> Calibrar la intensidad de la luz del estimulador óptico con fotómetro. </li><li> Monte la cámara de grabación en la platina del microscopio invertido. </li><li> La burbuja de la solución de perfusión con 95% O 2 / 5% CO 2, que se incuba a 40 ° C baño de agua para aumentar la solubilidad de CO 2. La solución de los flujos de la botella a la cámara de grabación que pasa a través de una resistencia de cerámica de calentamiento a 36-38 ° C. El calentador debe colocarse lo más cerca a la cámara de grabación como sea posible, idealmente en la platina del microscopio. </li><li> Ajuste el regulador de flujo para un caudal de alrededor de 1-1,5 ml / min. </li><li> Llenar el electrodo de registro con la solución de referencia. Insertar el electrodo en un porta-electrodos. Asegúrese de que no haya burbujas en el electrodo. Monte el soporte en el headstage del amplificador. Conecte el soporte a un dispositivo de succión, que se construye mediante la conexión de la tubería parcialmente llena con aceite mineral para el puerto lateral del porta-electrodos. El otro extremo del tubo está conectado a un pequeño depósito de aceite mineral, a la que la presión se puede aplicar por vía oral. </li><li> Conecte el electrodo de referencia al otro polo de la headstage. Obligar a la par térmico (TC) para el electrodo de referencia. Asegúrese de que las puntas de los electrodos y TC están muy juntos para que la lectura de la temperatura se toma como cerca de la célula como sea posible. </li><li> Encienda la iluminación infrarroja para visualizar el electrodo. El electrodo es visto por la cámara de infrarrojos conectada a un monitor. Centro del electrodo de la imagen en el campo visual y del monitor mediante un micromanipulador. </li><li> Ajustar la posición de la punta del electrodo de referencia cerca (2-4 mm) a la punta del electrodo de registro. </li><li> Ajustar el voltaje de CC para el calentador de modo que la temperatura de la solución es de 36-38 º C. </li><li> Realizar una prueba de sello para comprobar la resistencia de electrodo de registro, por lo general alrededor de 900 kW. </li></ol> Aislamiento de la retina del ratón <ol start="18"><li> Bajo tenue luz roja, la eutanasia el ratón adaptado a la oscuridad con el CO 2 y la dislocación cervical. Marcar los globos oculares con la punta de una antorcha de metal caliente de la cauterización de los punto más dorsal de la esclerótica un poco. Enucleación del globo ocular con unas tijeras. Todos los procedimientos posteriores se realizan bajo la luz infrarroja. </li><li> Hemisect los ojos bajo el microscopio con iluminación infrarroja y los convertidores de la imagen. </li><li> Retire la córnea y el cristalino. Eliminar la mayor cantidad de vítreo como sea posible. </li><li> Para grabar cono M-respuestas, eliminar la parte ventral de la ojera 4 con una cuchilla de afeitar a juzgar por la marca de la cauterización. </li><li> Pelar la retina de la capa de epitelio pigmentario. </li><li> Aplanar la retina y lo coloca en la parte inferior de la placa de Petri llenas de 1.2 ml solución de referencia. </li><li> Cortar la retina en pequeños trozos delgados con una cuchilla de afeitar y se incuba la preparación en una caja a prueba de luz saturada con oxígeno puro. </li></ol> Grabaciones <ol start="25"><li> Apague el calentador de forma temporal. Cambiar el flujo de perfusión a una tubería de derivación para evitar que la cámara de secado. </li><li> Drenan la mayor parte de la solución en la cámara usando un pedazo de tejido Kimwipe. Transferir la suspensión de la retina a la cámara de grabación con una pipeta de vidrio. </li><li> Espere unos 2 minutos hasta que las rodajas de retina se establecen. Interruptor de la perfusión de nuevo. Encender el calefactor. </li><li> Activar la iluminación infrarroja para visualizar la preparación. Búsqueda de un pedazo de retina tendido en la cámara con segmentos fotorreceptor exterior sobresaliendo (ver figura ejemplo). Dibuja los segmentos internos suavemente en el electrodo por la succión. En esta configuración, varios núcleos y segmentos internos debe ser elaborado en el electrodo. Registrar la photoresponse un destello brillante para probar si un segmento de cono interno está en el electrodo de la célula y si es curartu, a juzgar por la cinética de la respuesta y la amplitud. </li><li> Inferior del depósito mineral para aplicar una ligera presión negativa a la punta del electrodo para ayudar a sostener el segmento de interior en el electrodo. </li><li> Registro de flash de prueba, las respuestas de atenuar la intensidad luminosa vez que una célula se encuentra bien. Destellos de prueba son siempre de un estimulador de calibrado óptico de 5. La intensidad del flash y la longitud de onda son controlados por un conjunto de filtros de densidad neutra y filtros de interferencia de banda estrecha, respectivamente. Prueba de Flash duración (20 ms) es controlado por ordenador basada persianas. </li></ol> Soluciones <ol><li> Ratón solución de perfusión: 112,5 mM NaCl, 3,6 mM KCl, 2,4 mM MgCl 2, 1,2 mM CaCl 2, 10 mM HEPES (pH 7,4), 20 mM NaHCO 3, 3 mM Na succinato, 0,5 mM Na glutamato, 0,02 mM EDTA, y 10 mM de glucosa. </li><li> Grabación del ratón electrodo solución: 140 mM NaCl, 3,6 mM KCl, 2,4 mM MgCl 2, 1,2 mM CaCl 2, 3 mM HEPES (pH 7,4), 0,02 mM EDTA. </li></ol>

<ol><li>Yau, K. W., Lamb, T. D., Baylor, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+fluctuations+in+membrane+current+of+single+toad+rod+outer+segments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Light-induced fluctuations in membrane current of single toad rod outer segments.</a> Nature. 269, 78-80 (1977).</li>
<li>Nikonov, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoreceptors+of+Nrl+-%2F-+mice+coexpress+functional+S-+and+M-cone+opsins+having+distinct+inactivation+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Photoreceptors of Nrl -/- mice coexpress functional S- and M-cone opsins having distinct inactivation mechanisms.</a> J Gen Physiol. 125, 287-304 (2005).</li>
<li>Nikonov, S. S., Kholodenko, R., Lem, J., Pugh, E. N. JR <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+features+of+the+S-+and+M-cone+photoreceptors+of+wild-type+mice+from+single-cell+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Physiological features of the S- and M-cone photoreceptors of wild-type mice from single-cell recordings.</a> J Gen Physiol. 127, 359-374 (2006).</li>
<li>Applebury, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+murine+cone+photoreceptor%3A+a+single+cone+type+expresses+both+S+and+M+opsins+with+retinal+spatial+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The murine cone photoreceptor: a single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning.</a> Neuron. 27, 513-523 (2000).</li>
<li>Cornwall, M. C., Fein, A., MacNichol, E. F. JR <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+mechanisms+that+underlie+bleaching+and+background+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cellular mechanisms that underlie bleaching and background adaptation.</a> J Gen Physiol. 96, 345-372 (1990).</li>
<li>Calvert, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phototransduction+in+transgenic+mice+after+targeted+deletion+of+the+rod+transducin+alpha+-subunit%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Phototransduction in transgenic mice after targeted deletion of the rod transducin alpha -subunit.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 13913-13918 (2000).</li>
</ol>

Una sola célula de grabación de aspiración de las células fotorreceptoras se desarrolló hace 3 décadas. Que nos permite grabar través de la membrana cambio de corriente inducida por la estimulación de la luz, sin penetrar la membrana celular. Debido a la alta adhesión célula-célula, es difícil aislar la barra saludable único y el cono de la retina del ratón, como la retina de anfibios y es difícil de encontrar conos individuales debido al bajo porcentaje (3%) y pequeño tamaño. El segmento de interior-en-(IS-in) método d...

una sola célula grabaciones de succión de los conos del ratón

Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors

Fotorreceptores de los bastones y conos en la retina es responsable de la detección de la luz. En la oscuridad, los nucleótidos cíclicos-cerrada (CNG) de canales en el segmento externo están abiertos y permiten el flujo de cationes a ritmo constante hacia el interior a través de la membrana, despolarización de la célula. Exposición a la luz desencadena el cierre de los canales de GNC, bloquea el flujo de cationes corriente de entrada, por lo que resulta en la hiperpolarización de la célula. Con base en la polaridad de los fotorreceptores, un método de grabación de succión se desarrolló en 1970 que, a diferencia de la clásica técnica de patch-clamp, no requiere penetrar en la membrana plasmática<sup&gt; 1</sup&gt;. Dibujar el segmento externo en una pipeta de vidrio bien instalados llena con solución extracelular permite registrar los cambios actuales en las células individuales a la exposición de pruebas flash. Sin embargo, esta bien establecido &quot;exterior del segmento en el (OS-in)&quot; de grabación de succión no es adecuado para las grabaciones de cono del ratón, por el bajo porcentaje de conos en la retina del ratón (3%) y las dificultades para identificar el cono segmentos exteriores. Recientemente, un segmento interno-en (IS-in) de registro de configuración ha sido desarrollado para dibujar el segmento de interior / región nuclear de los fotorreceptores en la pipeta de grabación<sup&gt; 2,3</sup&gt;. En este video, vamos a mostrar cómo grabar desde cada photoresponses ratón cono con una sola célula de electrodos de succión.

Le mostraremos cómo registrar las respuestas de flash de conos ratón utilizando un electrodo de succión.

Una sola célula grabaciones de succión de los conos del ratón

Los fotorreceptores de bastones y conos en la retina son responsables de la detección de la luz. En la oscuridad, los canales regulados por nucleótidos cíclicos (CNG) en el segmento externo...

Este video demuestra la disección de la retina de ratón y la posterior obtención de grabaciones de succión a nivel de célula individual en los conos. Los ojos de un ratón sacrificado y adaptado a la oscuridad se cauterizan en la parte dorsal y se nuclean bajo luz roja tenue. A continuación, los ojos se seccionan en hemicírculos.A lo largo del ecuador, se extraen la córnea y las partes ventrales de los globos oculares. Se aísla la retina dorsal de la capa de epitelio pigmentario y se corta en pequeños trozos delgados utilizando una hoja de afeitar. Los fragmentos de retina se colocan luego en la cámara de registro que encaja en la platina de un microscopio.Varios cuerpos celulares de fotorreceptores se introducen en el electrodo de registro. Cuando un fotorreceptor de cono se introduce en el electrodo, un destello de prueba brillante inducirá una respuesta fotóica con una amplitud superior a cuatro picoamperios. Hola. Hola. Soy Jin del Laboratorio del Dr. Mir Kops en el Departamento de Oftalmología y el censo visual de la Universidad de Washington en St. Louis.Hoy les mostraremos un procedimiento para registrar respuestas fotónicas de fotorreceptores individuales de Moscon. Utilizam

single-cell-suction-recordings-from-mouse-cone-photoreceptors

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Aquí se describe un procedimiento para la generación adaptada a la oscuridad rebanadas de la retina del ratón de los registros electrofisiológicos.

Grabaciones de patch clamp de neuronas de ratón de retina en una rebanada preparación adaptada a la oscuridad

Se describe un método relativamente simple de transretinal electrorretinograma (ERG) para la obtención de grabaciones photoresponses conos y bastones de la retina del ratón intacto. Este enfoque se aprovecha del bloque de la transmisión sináptica de fotorreceptores para aislar sus respuestas de luz y grabar usando electrodos colocados sobre el terreno a través de la aislada plana montada en la retina.

Transretinal Grabaciones ERG de retina del ratón: Rod y el Cono Photoresponses

Fuente: Laboissonniere, et. al. Secuenciación de ARN unicelular de subconjuntos definidos de células ganglionares de la retina. J. Vis. Exp. (2017).  Este video muestra una técnica de trazado fluorescente para identificar subtipos de células ganglionares de la retina (RGC) en la retina de un ratón transgénico. El proceso consiste en asegurar la retina aislada en una cámara de registro, mantener la viabilidad celular con perfusión oxigenada y dirigirse a las RGC marcadas con fluorescencia...

Identificación de subtipos de células ganglionares de la retina de ratón mediante trazado fluorescente

Fuente: Kulkarni, M. et al. Imágenes de la dinámica de Ca2+ en los terminales de los axones fotorreceptores de cono de la retina del ratón. J. Vis. Exp. (2015)Este video demuestra el uso de la microscopía de dos fotones para monitorear la dinámica del calcio en los fotorreceptores de cono de la retina de un ratón transgénico. Describe los pasos para preparar cortes de retina, obtener imágenes de biosensores de calcio basados en FRET y analizar los cambios de fluorescencia para cuantificar los...

Microscopía de dos fotones para monitorizar la dinámica del calcio en los fotorreceptores de los conos de la retina de los ratones

Se describe la preparación de rodajas finas de la retina acuáticos salamandras tigre...

Simultáneas registros de células de fotorreceptores y las neuronas de segundo orden en una rebanada preparación retina Anfibios

Retina neural de un ratón envejecido 8 días es en la parte superior de un bloque de gelatina 4%. Después del aislamiento de la capa de fotorreceptores (200 m) por vibratome, los fotorreceptores se siembran después de la disociación mecánica y enzimática para la cultura. La capa de fotorreceptores se puede utilizar para, análisis o trasplante bioquímicos moleculares.

Vibratome Seccionamiento retina del ratón para preparar cultivos de fotorreceptores

Demostraremos cómo preparar cortes de retina a partir del ojo del ratón y registrar las respuestas a la luz en las neuronas de la retina. Todo el procedimiento se lleva a cabo en condiciones adaptadas a la oscuridad.

Grabación Luz evocó-Respuestas postsinápticos en las neuronas en adaptadas oscuro, Preparaciones ratón retina Slice Uso de técnicas Patch Clamp

Se describe un protocolo para supervisar Ca 2+ dinámica en los terminales de los axones de los conos utilizando una preparación rebanada ex-vivo de la retina del ratón. Este protocolo permite estudios completos sobre los conos de señalización de Ca2 + en un importante sistema modelo de mamífero, el ratón.

Imagen Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Dinámica de Terminales cono fotorreceptor axón de la retina del ratón

Hemos desarrollado una preparación rebanada horizontal de la retina de mamíferos adultos con el plano de seccionamiento en paralelo a la superficie de la retina. campos dendríticas de las neuronas de la retina orientadas nonradially no fueron truncados, lo que permite el estudio de las técnicas de procesamiento de señales con patch-clamp y de imagen.

Preparación de cortes horizontales de ratón adulto Retina de Estudios electrofisiológicos

Aquí, presentamos un enfoque combinatorio para clasificar los tipos de células neuronales antes del aislamiento y para la posterior caracterización de los transcriptomas de una sola célula. Este protocolo optimiza la preparación de muestras para el éxito de secuenciación de ARN (RNA-Seq) y describe una metodología diseñada específicamente para la mejora de la comprensión de la diversidad celular.

RNA-Seq de una sola célula de subconjuntos definidos de células de ganglio retiniano

Describimos un método para obtener cultivos primarios de fotorreceptores de cono de la retina de embriones de pollo y su uso para la detección de alto contenido.

Cultivos Enriquecidos con Conos De La Retina De Embriones De Pollo Para Estudiar Las Interacciones Celulares De Varilla A Cono

Aprende a registrar respuestas de fotoreceptores cónicos individuales en ratón mediante electrodo de succión. Este método de electrofisiología permite estudiar la fisiología celular y las propiedades de adaptación de los conos en neurociencia visual.

Una sola célula grabaciones de succión de los conos del ratón

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