Name: 조직학, 조직 형태 측정 및 분석을위한 Fluorochrome Undecalcified 본 준비 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-08T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: 학습하세요 탈석되지 않은 뼈 조직학 기법으로 뼈 미세구조와 광물질 성분을 분석하는 방법을. 큰 표본의 섹션 제작 과정과 형광색 평가를 통한 정량적 분석 기술을 익혀 임상 및 연구에 활용하세요.

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저자는 그녀의 실험실 전문 수지 퍼가기와 MS Stephania 무덤에 그녀 전문 숄 수 코넬의 도움을 인정하고 싶습니다. 저자는 자신의 조언을 교수 프랭크 Kandziora 및 박사 마리 앤 Polboth 감사하고 싶습니다.

<ol><li> 조직은 10 % 인산을 포함하는 밀봉된 컨테이너가 포르말린 용액 3 버퍼에 저장됩니다. fluorochrome 분석 fluorochromes가 빛을 구분으로 수행할 수있다면, 빛을 최소한의 노출을 보장합니다. </li><li> 필요하게 될 조직의 어느 방향 수립. </li><li> 크기로 시편을, 트림 올바른 방향으로, 밴드를 사용하여 보았다. 안전 보장 조치을 준수하고 있습니다. 표본은 다음 불투명 용기에 위치의 볼륨 충분한 고정을 달성하기 위해 약 10 배 정도 표본의 크기가되어야합니다. 표본은 포르말린 용액의 크기에 따라 한 사이에 두 주간의 총 유지됩니다. 이것은 테스트 및 최적화 목적으로 컨트롤 조직을 사용하여 제안합니다. </li><li> 조직이 포함 금형에 맞는 선택하고 70 % 에탄올을 포함하고있는 밀폐된 불투명 용기에 조직을 놓으십시오. </li><li> 빛과 지속적인 동요에 따라 차폐 에탄올의 농도를 오름차순으로 조직을 처리합니다. <ol class="lalpha"><li> 70% 에탄올 일주 </li><li> 80% 에탄올 일주 </li><li> 90% 에탄올 일주 </li><li> 백퍼센트 에탄올 일주 </li></ol></li><li> 조직은 다음에 다시 빛으로부터 지속적인 동요에 따라 차폐, 1 주일 butanol에서 지워집니다. </li><li> 수지와 뼈 밀도가 밀접 수지 밀도가 (8 단계 참조) 변경할 수 있습니다. 일치하는 우리는 정확한 밀도를 보장하기 위해 먼저 테스트 표본을 포함하는 것이 좋습니다해야합니다. 우리는 가벼운 현미경과 fluorochrome 분석을위한 Technovit 7100 (Heraeus Kulzer)를 사용합니다. immunohistochemistry가 필요한 경우 대체 수지는 그러한 Technovit 9100 (Heraeus Kulzer)로 사용해야합니다. </li><li> Technovit 7100 준비 솔루션이 필요 경우, 키트와 함께 제공되는 베이직 솔루션의 작은 aliquots와 혼합 수 있지만 더 이상 5 이상의 %를 준비 솔루션의 볼륨, 우리의 경험에 부드럽게 솔루션은 거의 필요하지 않습니다. 절대 에탄올과 기본 액체 Technovit 7100 동등한 부분은 빛의 노출을 최소화 24 시간 동안 미리 침투 솔루션으로와 교반과 혼합하여 조직에 적용됩니다. </li><li> 침투 솔루션은 다음 100 ML베이스 액체에 녹아있다 1g의 경화제 I을 (= 1 봉지)를 사용하여 구성되어 있습니다. 이것은 미리 침투 솔루션을 대체하고 지속적인 교반에 따라 1 주일 침투 수 있습니다. </li><li> 아래로 절단 표면 얼굴, 금형에 조직을 놓으십시오. 수지에 대한 조직 주위에 여백이 (이상 최소한 5mm)가 있는지 확인합니다, 이것은 블록의 강도를 보장합니다. 경화제 II 1 ML과 Technovit 7100 준비 솔루션의 15mls을 혼합하여 몰드에 시료 주위에 기름을 붓고 적어도 5 millimietres하여 커버. 경화 2 시간 이내에 시작되지만 밤새 완료됩니다. </li><li> 장착은 다음 Technovit 3040 (Heraeus Kulzer)을 사용하여 백업 블록을 도운하여 수행됩니다. 가루 한 부분 액체에 점성 액체를 얻는 2 부분의 볼륨 비율 Technovit 3040를 섞습니다. 블록의 기지 위에서 최소한 2 mm의 수준으로 블록의 뒷면에있는 쉬는 시간에 Technovit 3040 하거라. 약 10 분 후 금형이 떨어져 벗겨와 블록이 준비하실 수 있습니다. </li><li> 밀도 따라서 메타 크릴 레이트 수지의 절단 속성은 방에있는 주위 습도에 취약합니다. 블록 따라서 dessicator에 보관해야합니다. </li><li> 그라운드 sectioning는 두께 20-50 micrometres 사이의 큰 부분을 생산하고 있습니다. 두꺼운 섹션 밝은 형광을 생산로 (아래 부분을 참조) fluorochrome 분석에 유용합니다. macrotome에 다이아몬드 블레이드를 고정합니다. macrotome에있는 저수지 이러한 석유 정신으로 윤활유를 추가합니다. 클램프의 블록을 안전하고 블레이드에 동쪽을 향하게하다. 적절한 윤활을 보장 (섹션 약 20~30분) 천천히 발생하는 연삭 수 있습니다. 첫 번째 섹션은 절단 얼굴을 노출하고 섹션이 - 그것이 폐기되어야 orientates. </li><li> 다음 섹션은 다음 Superfrost 플러스 슬라이드에 배치됩니다. 섹션은 우리가 위에 샌드위치 가방의 일부를 삽입하여 다른 슬라이드 장소에 고정되어와 함께 그것이 평면 유지하는 것이 좋습니다 때문에 침묵하는 경향이 있습니다. 그 다음 1 시간 동안 섭씨 60-80도 사이의 인큐베이터로 배치됩니다. 이것은 메타 크릴 레이트를 부드럽게하고 섹션 평면 방식으로 슬라이드를 준수하는 데 도움이됩니다. </li><li> 부드러운 방식으로 미세 그릿 샌드페이퍼를 사용하여 필요에 따라 지상 부분은 세척 및 연마 수 있습니다. </li><li> 슬레지 마이크로톰는 얇은 섹션을 삭감하는 빛의 microsocopy위한 최상의 섹션을 제공합니다. 그것이 하드 블록을 절삭에 필요한 강성을 추가했습니다 같은 슬레지 마이크로톰을 사용합니다. 또는 전원 로타리 마이크로톰 사용할 수 있습니다. 날카로운 스테인레스 스틸 칼날을 사용합니다. 그것은 하나가 사용하는 다른처럼 날카롭게 수 있듯이 두 가지 블레이드를 가질 것이 바람직합니다. 블레이드는 블록과 45도 각도를해야합니다. 스rface의 연화가 필요한 경우 블록에 젖은 종이를 적용하여 얻을 수 있습니다. 그것은 품질 섹션을 얻기 위해 원하는 절삭 조건을 달성하기 위해 여러 섹션을 걸릴 수 있습니다. 섹션 다음 물을 욕조에 떠올 랐 이상 16으로 슬라이드에 배치됩니다. </li><li> 얼룩의 시약은 다음과 재료에 나열되어 있습니다. 프로토콜은 밴크로프트 외 4를 기반으로합니다. 때문에 두께 변화에 그것은 테스트 슬라이드에 얼룩을 최적화하는 것이 좋습니다. 랙 얼룩은 조직이 필요할 수 있습니다 평면 슬라이드에 직접 얼룩을 추가 있도록 슬라이드를 플로트가 발생할 수 있습니다. 동일한 프로토콜 또는 랙 얼룩은 조직 형태 측정에 필요한 지속적인 얼룩의 결과를 위해 필요합니다. <ol class="lalpha"><li> Haematoxylin과 Eosin <ol class="lroman"><li> Haematoxyilin 5~10분와 스테인 </li><li> 스콧의 수돗물로 잘 씻으십시오 </li><li> Eosin 오분와 스테인 </li><li> 수돗물에 세척 </li><li> 크실렌에 지우기 </li><li> 마운트 </li><li> 검색 결과 <ol><li> 뼈 같은 = 핑크 </li><li> Calcified 뼈 = 보라색 갈색 </li><li> 핵 = 파란색 </li></ol></li></ol></li><li> 본 K​​ossa <ol class="lroman"><li> 실버 질산 용액에 플레이스와 mineralized 뼈가 검은 전환까지 강한 빛에 노출 (약 10 분) </li><li> 증류수로 세 번 씻어 </li><li> 5 분 나트륨 thiosulfate와 위협 </li><li> 증류수로 세척 </li><li> Safrinin O와 Counterstain </li><li> 크실렌에 지우기 </li><li> 마운트 </li><li> 검색 결과 <ol><li> Mineralised 뼈를 = 검은색 </li><li> 뼈 같은 = 레드 / 핑크 </li></ol></li></ol></li><li> 메이슨 골드너 S Trichrome <ol class="lroman"><li> (80 % 에탄올의 90mls 20 분 25 % 암모니아 10mls) 알칼리성 알코올로 세척 </li><li> 물에 린스 </li><li> 증류수로 씻어 </li><li> 10 분 Weigert의 Haematoxylin와 스테인 </li><li> 증류수로 씻어 </li><li> 개양귀비빛의 - Fuchsin 최종 솔루션 오분와 스테인 </li><li> 1퍼센트 초산과 함께 15 초 린스 </li><li> phosphomolybdic 산성 - 오렌지 G 솔루션 5 분 스테인 </li><li> 1퍼센트 초산과 함께 15 초 린스 </li><li> 밝은 녹색 오분와 스테인 </li><li> 1퍼센트 초산 3 변경 린스 </li><li> 증류수로 씻어 </li><li> 마운트 </li><li> 검색 결과 <ol><li> Mineralised 뼈를 = 녹색 </li><li> 뼈 같은 = 레드 / 오렌지 </li><li> 핵 = 블루 그레이 </li><li> 연골 = 보라색 </li></ol></li></ol></li></ol></li><li> Fluorochrome 준비 : </li><li> 이들은 최소 2 주 간격, 천천히 정맥 주사에​​ 의해 관리됩니다. </li><li> 복용 <ol class="lalpha"><li> Calcein 그린 10 MG / kg IV </li><li> Oxytetracycline 50 MG / kg IV </li><li> 알리 자린 Complexone 30 MG / kg IV </li></ol></li><li> Calcein 그린의 준비 <ol class="lalpha"><li> 녹아까지 Calcein 그린 중 하나 그램은 1 M NaOH와 titrated 있습니다. </li><li> 산도는 산도 = 7.1-7.2까지 1% NaOH로 조정됩니다. </li><li> 필터와 빛으로부터 격리 보관 </li></ol></li><li> 알리 자린 Complexone의 준비 <ol class="lalpha"><li> 녹아까지 알리 자린 complexone 세 그램은 1 M NaOH와 titrated 있습니다. </li><li> 산도는 다음 산도 = 7.1-7.2까지 1퍼센트 HCL 또는 NaOH로 조정됩니다. </li><li> 필터와 빛으로부터 격리 보관 </li></ol></li><li> Oxytetracycline의 준비 <ol class="lalpha"><li> Oxytetracycline은 선반에서 안티 - 미생물의 약물로 사용할 수 있습니다. 아무 준비도 필요하지 않습니다. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Kerr, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKerr%2C+J+%22Atlas+of+Functional+Histology%22">Atlas of Functional Histology</a>. , Harcourt Publishing. Melbourne, Australia. 164-168 (2000).</li>
<li>Parfitt, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+histomorphometry%3A+standardization+of+nomenclature%2C+symbols%2C+and+units.+Report+of+the+ASBMR+Histomorphometry+Nomenclature+Committee%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Bone histomorphometry: standardization of nomenclature, symbols, and units. Report of the ASBMR Histomorphometry Nomenclature Committee.</a> J Bone Miner Res. 2, 595-610 (1987).</li>
<li>An, Y. H., Martin, K. l <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAn%2C+YH+%22Handbook+of+histology+methods+for+bone+and+cartilage%22">Handbook of histology methods for bone and cartilage</a>. , Humana Press Inc. New Jersey, USA. (2003).</li>
<li>Bancroft, J. D., Gamble, M. Theory and Practice of Histological Techniques. , Churchill Livingston. Nottingham, United Kingdom. 352-360 (2008).</li>
</ol>

용매 : <ul><li> 일반 10 % 포르말린, 에탄올, 크실렌 및 Butanol 산성을 버퍼 모든 조직학 등급, 유황 무료입니다. Grale 과학 PTY 주식 회사 http://www.grale.com.au </li></ul> 마울즈 : <ul><li> 멀리 껍질, 플라스틱 금형 Grale 과학 </li></ul> 슬라이드 : <ul><li> SUPERFROST 플러스 현미경 슬라이드 롬 과학 PTY 주식 회사 <a href="http://www.lomb.com.au/">http://www.lomb.com.au</a> </li></ul> 수지 : <ul><li> GlycolMethacrylate의 Technovit 7100 Heraeus Kulzer <a href="http://www.kulzer-technik.de/168/Products/Histology/Technovit_7100.htm">http://www.kulzer-technik.de/168/Products/Histology/Technovit_7100.htm</a> </li><li> 블럭 수지 Technovit 3040 조직을 블록을 백업 Heraeus Kulzer </li></ul> 얼룩 (Grale 과학에서 시약) 골드너의 Trichrome는 얼룩 </li> 1. Weigert의 철 hemotoxylin (DeGroat) <table style="margin-left:40px;" border="0"><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> A) Hemotoxylin 솔루션 </td></tr><tr><td> Hemotoxylin </td><td> 1g </td></tr><tr><td> 절대 알콜 </td><td> 100mL </td></tr><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> B) 이런 솔루션 </td></tr><tr><td> 30% 수성 산화철 염화물 </td><td> 4mL </td></tr><tr><td> 염산 (집중) </td><td> 1mL </td></tr><tr><td> 증류수 </td><td> 95mL </td></tr></table> 필터링과 같은 hemotoxylin의 볼륨을 바로 전에 얼룩은 사용에 추가됩니다. 2. 개양귀비빛의 - fuchsin - azophloxin 주식 솔루션 <table style="margin-left:40px;" border="0"><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> A) 개양귀비빛의 드 xylidine 솔루션 </td></tr><tr><td> 개양귀비빛의 데 xylidine </td><td> 0.75g </td></tr><tr><td> 산성 fuchsion </td><td> 0.25g </td></tr><tr><td> 아세트산 </td><td> 1mL </td></tr><tr><td colspan="2"> 믹스, 그리고 추가 증류수 (100mL) </td></tr><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> B) azophloxin 솔루션 </td></tr><tr><td> Azophloxin </td><td> 0.5g </td></tr><tr><td> 초산 </td><td> 0.6mL </td></tr><tr><td colspan="2"> 믹스, 그리고 추가 증류수 (100mL) </td></tr><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> C) 최종 얼룩 솔루션을 작동 </td></tr><tr><td> 개양귀비빛의 - fuchsin 솔루션 </td><td> 5 - 10mL </td></tr><tr><td> Azophloxin </td><td> 2mL </td></tr><tr><td> 0.2 % 초산 용액 </td><td> 88mL </td></tr></table> 3. 라이트 그린 솔루션 <table style="margin-left:40px;" border="0"><tr><td> 연두빛 </td><td> 1g </td></tr><tr><td> 초산 </td><td> 1mL </td></tr><tr><td colspan="2"> 믹스, 그리고 증류수를 (500mL) 추가 </td></tr></table> 4. Phophomolybdic 산성 - 오렌지 G 솔루션 <table style="margin-left:40px;" border="0"><tr><td> Phosphomolybdic 수 소산 </td><td> 3g </td></tr><tr><td> 오렌지 G </td><td> 2g </td></tr><tr><td colspan="2"> 증류수 500mL에 용해의와 크리스탈 티몰를 추가합니다. </td></tr></table> 본 K​​ossa는 스테인 <table style="margin-left:40px;" border="0"><tr><td> 1퍼센트 수성 실버 질산 </td></tr><tr><td> 2.5 %의 나트륨 thiosulfate </td></tr><tr><td> 1퍼센트 safranin O </td></tr></table> Alcian 파란색 얼룩 <table style="margin-left:40px;" border="0"><tr><td> Alcian 블루 8GX </td><td> 1g </td></tr><tr><td> 3퍼센트 아세트산 용액 </td><td> 100mL </td></tr></table> Hemotoxylin과 Eosin는 얼룩 <table style="margin-left:40px;" border="0"><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> A) 해리스의 hemotoxylin </td></tr><tr><td> Hemotoxylin </td><td> 2.5G </td></tr><tr><td> 절대 알코올 </td><td> 25mL </td></tr><tr><td> 칼륨 알룸 </td><td> 50g </td></tr><tr><td> 증류수 </td><td> 500mL </td></tr><tr><td> mercuric 산화물 </td><td> 1.25g OR </td></tr><tr><td> 나트륨 iodate </td><td> 0.5g </td></tr><tr><td> 빙초산 </td><td> 20mL </td></tr><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> B) Eosin 솔루션 </td></tr><tr><td colspan="2"> 상업 생산 Eosin가 사용되었습니다. </td></tr></table> 모든 얼룩 염색의 분말은 귀르 염료 분말입니다. 모든 시약은 분석 시약, 그리고하지 랩 시약 Fluorochromes <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tr><td> 제조 업체 </td><td> Fluorochrome </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> 시그마 - 알드리치, 시드니 </td><td> Calcein 그린 </td><td> C0875 </td></tr><tr><td> 시그마 - 알드리치, 시드니 </td><td> 알리 자린 Complexone </td><td> A3882 </td></tr><tr><td> 인터 베트 오스트 레일 리아, 빅토리아 </td><td> Oxytetracycline (선반 항균 약물 할인) </td><td> Tradename; Engemycin 100 </td></tr></table>

조직학, 조직 형태 측정 및 분석을위한 fluorochrome undecalcified 본 준비

Undecalcified Bone Preparation for Histology, Histomorphometry and Fluorochrome Analysis

Undecalcified 뼈 조직학은 뼈의 마이크로 아키텍처를 보여줍니다. 그것은 뼈 회전율이나 뼈 형성과 재흡수에 대한 중요한 정보를 제공 뼈의 mineralized과 세포 구성 요소를 모두 보여줍니다. 이것은 임상 및 연구 애플 리케이션의 다양한 엄청난 중요성을했다. 그것은 아름다운 이미지 1을 산출 등 fluorochrome 평가 및 조직 형태 측정이 같은 기술을 허용합니다. Fluorochrome 분석 칼슘에 바인딩 형광 염료가 그 주어진 시간에 mineralization의 금액의 부량을 허용 특정 시점에서 주입하는 기술입니다. 조직 형태 측정은 현미경 수준에서 뼈 부량의 과정이다. undecalcified 뼈 조직학을 수행하는 것은 기술적으로 특히 대형 표본과 도전이다. 그것은 조직학 임베디드 표준 파라핀에 사용되는 이들의 기술 변화가 필요합니다. 이 동영상은 좋은 품질의 섹션을 제작하는 과정을 설명하고이를 극복하기 위해있는 기술적인 문제와 방법을 보여줍니다. 표본 준비, 고정 및 처리는 종종 몇 주간 복용 밀도와 낮은 뼈의 투자율 상당히 긴 고정 및 처리 시간이 필요하기 때문에 그러나 다른 부드러운 조직과 유사한 방식으로, 함께 달성하고 있습니다. 퍼가기 그러한 메타 크릴 레이트 기반 수지로 뼛속까지 비슷하거나 동일한 경도와 밀도 지원 매체를 사용하여 달성하지만, 파라핀 침투와 포함 달리, 이것은 돌이킬 단계입니다. Sectioning 그러한 fluorochrome 분석과 같은 연구를위한 최적있는 두꺼운 섹션을 생산하는 연삭에 의해 얻을 수 있습니다. 이것은 가장 macrotome에 다이아몬드 블레이드를 사용하여 이루어진다. 또한, 얇은 부분은 빛을 현미경을 위해 생산 수 있으며 이것은 매우 날카로운 칼날과 슬레지 마이크로톰를 사용하여 이루어진다. 썰매 마이크로톰 큰 하드 블록에 필요한 추가적인 강도와 안정성을 제공합니다. 수지 포함된 섹션은 시연 아르 얼룩 다양한 물들일 수 있습니다.

Undecalcified 뼈 조직학은 임상 및 연구 애플 리케이션의 다양한 중요 정보를 제공합니다. 그것은 기술적으로 특히 대형 표본과 도전이다. 이 동영상은 좋은 품질의 섹션을 제작하는 과정을 설명하고이를 극복하기 위해있는 기술적인 문제와 방법을 보여줍니다.

조직학, 조직 형태 측정 및 분석을위한 Fluorochrome Undecalcified 본 준비

비탈석석회화 골 조직학은 골격의 미세 구조를 보여줍니다. 이는 골의 석회화 성분과 세포 성분을 모두 나타내어 ...

탈회 골 조직학은 뼈의 광화 성분과 세포 성분을 모두 보여주는 뼈의 미세구조를 나타내며, 골 turnover 또는 골 형성 및 흡수에 관한 중요한 정보를 제공합니다. 이는 다양한 임상 및 연구 응용 분야에서 매우 큰 중요성을 가집니다. 이를 통해 아름다운 이미지를 얻을 수 있으며 형광 평가 및 조직 광학 측정과 같은 기술을 적용할 수 있습니다.석회화된 뼈 조직의 조직학적 분석을 수행하는 것은 기술적으로 까다로우며, 특히 표본의 크기가 클 때 더욱 그렇습니다. 본 영상에서는 뼈의 석회화 하부 단면을 얻는 과정에서 발생하는 기술적 어려움과 이를 극복하는 방법을 보여드립니다. 해당 단면들의 조직 형태 계측학적 평가는 다루지 않습니다.이를 위해 다음의 중요한 출판물을 참조하시기 바랍니다. 본 영상에서는 조직 채취 후의 검체 준비 및 고정 처리, 연마 및 절단을 포함한 포매 및 절편 제작, 슬라이드 제작 및 염색 과정을 다룹니다. 검체.이 경우, 양의 경추를 10% phosphate buffered formula 및 용액이 들어 있는 밀봉된 불투명 용기에 넣습니다. 형광 염료 분석을 수행하는 경우 빛 노출을 최소화해야 합니다. 형광 염료는 빛에 민감하므로, 검체를 실험실로 옮겨 크기에 맞게 다듬으며, 이는 고정 상태를 개선하고 블록에 적합하게 들어갈 수 있도록 합니다.블록을 정확한 평면으로 제작하기 위해 이 시점에서 슬라이드 위 조직의 방향을 파악해야 합니다. 안전이 매우 중요하므로, 손이 칼날에 닿지 않도록 도구를 사용하여 작업해야 합니다. 이제 관심 영역이 크기에 맞게 트리밍되었습니다.그 후, 조직 손실을 최소화하기 위해 더 작은 밴드 쏘(band saw)로 최종 트리밍을 수행합니다. 블록을 원하는 크기로 절단하면, 고정을 완료하기 위해 신선한 고정액이 들어 있는 밀폐된 불투명 용기에 넣습니다. 용기의 부피는 시편 크기의 약 10배가 되어야 합니다.적절한 고정을 위해, 시료의 크기에 따라 1~2주 동안 정해진 처방의 용액에 보관한 후 70% Ethanol로 옮깁니다. 블록의 크기가 크고 뼈의 투과성이 낮아 용매의 확산 속도가 느리므로, 이후 공정은 천천히 진행합니다. 그다음 농도가 증가하는 순서의 에탄올을 사용하여 탈수 과정을 거친 후, 부탄올로 투명화 처리를 합니다. 시료는 빛을 차단한 상태에서 지속적으로 교반하며 보관합니다.각 용액에서 약 일주일 동안 처리하는 것을 권장합니다. 따라서 전체 처리 과정은 약 4~6주가 소요됩니다. 이를 서두르면 절편의 최종 품질이 저하될 수 있으므로 주의해야 합니다.석회화된 뼈를 위해 사용할 수 있는 다양한 포매 옵션이 있습니다. 수지 또는 메타크릴레이트의 선택은 테스트 목적에 따라 달라집니다. 예를 들어, 모든 수지에서 면역조직화학 염색이 가능한 것은 아닙니다.에폭시 수지는 경화를 위해 UV 광선이 필요하며, 이는 형광 색소 분석을 방해할 수 있습니다. 세심한 선택을 하기 전 제조사 사양서를 참조할 것을 권장합니다. 당사는 광학 현미경 관찰 및 형광 색소 분석을 위해 절단 및 연마 단면을 우수하게 생성할 수 있고 비용 효율적인 TEVI 7, 100을 사용합니다.포매 시 중요한 고려 사항은 뼈의 밀도와 포매제의 밀도가 밀접하게 일치해야 한다는 것입니다. 이는 나중에 블록을 절단할 때, 특히 마이크로톰 절편 제작 시 매우 중요하므로, 제조사의 지침에 따라 혼합물을 준비하고 강하게 흔들어 섞어줍니다. 프로토콜을 최적화하기 위해 몇 개의 테스트 샘플을 미리 포매해 보는 것이 좋습니다.파라핀과 달리, 이 단계는 가역적이지 않습니다. 블록의 절단면이 아래로 향하게 하여 몰드에 넣습니다. 지지력과 강도를 높이기 위해 몰드는 블록보다 더 큰 것을 사용합니다.메타크릴레이트(methacrylate)가 뼈 내부로 최대한 침투할 수 있도록 메타크릴레이트 침투는 천천히 진행해야 합니다. 마찬가지로, 빛에 노출되는 것을 최소화해야 합니다. 침투 용액을 사용한 지 일주일 후에 침투 용액을 교체하고 경화 용액을 추가합니다.그 다음 배킹 플레이트를 제작합니다. 이를 위해 tevit 30 40을 사용합니다. 이어서 몰드를 벗겨내면 블록이 준비됩니다.마모 절편 제작을 통해 20에서 50 µm 두께의 더 큰 절편을 얻을 수 있습니다. 절편이 두꺼울수록 형광이 더 밝게 나타나므로 형광 분석에 유용합니다. 마모 절편을 제작하려면 마이크로톰이 필요하며, 다이아몬드 칼날을 사용하는 것이 좋습니다. 본 실험에서는 0.6 mm 곡선 다이아몬드 칼날을 사용합니다.윤활제 사용이 필수적입니다. 실리콘 기반 윤활제도 효과적이지만, 석유 기반 윤활제 사용을 권장합니다. 그런 다음 블록을 클램프에 고정합니다.이를 매크로 텀(macro term)에 고정하고 블록을 칼날 쪽으로 전진시킵니다. 첫 번째 절편은 절단면을 노출시키고 절편의 방향을 잡는 용도이므로, 폐기해야 합니다.연마는 시간이 오래 걸리는 과정이므로 서두르지 않아야 합니다. 절편을 연마할 때 충분한 윤활이 이루어지도록 해야 합니다. 그 후 절편을 슬라이드 위에 올립니다.필요에 따라 세척 및 연마를 수행할 수 있습니다. 절편이 말리는 경향이 있으므로, 지퍼백의 일부를 그 위에 덮고 다른 슬라이드로 고정하여 평평하게 유지하는 것을 권장합니다.그 후 60~80°C의 인큐베이터에 1시간 동안 넣어둡니다. 이렇게 하면 메타크릴레이트가 연해져 절편이 슬라이드에 평평하게 부착되는 데 도움이 됩니다. 여기서는 한 달 간격으로 주입한 세 가지 서로 다른 형광색소의 합성 형광 이미지를 볼 수 있습니다.이를 통해 특정 시점의 석회화 부위를 식별할 수 있습니다. 이러한 표지자의 용량과 준비 방법은 본문에서 확인할 수 있습니다. 마이크로텀(micro term)을 사용하면 광학 현미경 관찰에 가장 적합한 박절편을 얻을 수 있습니다.이는 기술적으로 까다로운 과정입니다. 이러한 단단한 블록을 절단할 때 제공되는 추가적인 강도를 위해 슬레지 마이크로톰(sledge microtone)을 사용할 것을 권장합니다. 텅스텐 카바이드 칼날을 포함하여 다양한 칼날을 사용할 수 있습니다.하지만, 스테인리스 스틸 칼날은 필요에 따라 쉽고 빈번하게 다시 연마할 수 있으므로 이를 추천합니다. 칼날은 블록과 45도 각도를 이루도록 배치해야 합니다. 메타크릴레이트 밀도는 실험실 내 주변 습도를 포함한 여러 요인의 영향을 받기 쉽습니다.따라서 블록은 건조한 표면에 보관해야 합니다. 필요한 경우 블록에 젖은 종이를 덮어 연화시킬 수 있으며, 양질의 절편을 얻기 위한 적절한 절단 조건을 맞추기까지 여러 번의 절단 과정이 필요할 수 있습니다. 다시 한번, 절편을 인큐베이터에 넣기 전에 절편을 평평하게 만들기 위해 샌드위치 백과 추가 슬라이드를 사용하여 고정합니다.염색 과정은 일반적인 파라핀 매몰 조직학적 검사와 유사하지만, 왁싱 과정이 필요하지 않다는 점이 분명하게 다릅니다. 뼈 조직에 흔히 사용되는 염색법으로는 사프란 대조 염색을 병행한 VSA, 사프란, ol light green, 그리고 mass on golden as trione이 있습니다. 이에 대한 프로토콜은 본문에서 언급됩니다.시약은 사용 전 선택 및 여과 과정을 거칩니다. Golden 염색법은 조직 광학 측정(histo optometry)에 자주 사용됩니다. 먼저 테스트 슬라이드에서 염색 조건을 최적화하는 것을 권장합니다.각 단계 후에 현미경으로 슬라이드를 관찰하여 색상이 올바르게 나타나는지 확인하십시오. 이를 통해 각 성분 염색에 필요한 정확한 시간을 설정할 수 있습니다. 염색 표준이 최적화되면, 염색 편차가 열 기하학 구조에 영향을 주는 것을 방지하기 위해 실험의 모든 슬라이드를 랙에 넣고 동일한 프로토콜에 따라 동시에 염색합니다.그 다음 표준적인 방법으로 슬라이드 커버 글라스를 덮습니다. 귀하의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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조직학, 조직 형태 측정 및 분석을위한 Fluorochrome Undecalcified 본 준비

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