Name: ロボロリーパインからのRNA分離の改良法（ P. taeda L.）及びその他の針葉樹種 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-22T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: 学ぶロボロリーパイン（Pinus taeda）のキシレムと師部組織からの高品質RNA抽出法。フェノール類や多糖類による阻害を克服し、ゲノム解析に適したRNAを分離する実践的な技術を解説します。

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博士ジョーネアン、マットBryman、マイケルボルドー、Ujwal Bagal、Huizheジン、そしてアマンダBouffier：我々は、そのヘルプマツ組織の収集は不可能だったでしょうせずに次の人に感謝の意を表します。

パート1：ツリーの収穫 ツリーを選択し、伐採された後、それは慎重にし、可能な限り迅速に作業することが重要です。それぞれ別の組織の種類が収穫されているサンプルの材料の任意のクロスコンタミネーションを避けるために、彼らは自らの液体窒素容器にすぐに配置する必要があります。このRNAの分離のプロトコルがスケーラブルです。 <ol><li>ボルトの長手方向軸線に続く二、三箇所の樹皮は約0.5〜0.75メートルの長さにし、チェーンソーのスコアとボルトをカット。 </li><li>樹皮が木材から分離し、それが茎から完全に分離するまで樹皮のセクションに戻って引きながらノミを作業を続行し始めるまでの木材のみを使用して、得点領域の端を働く。 </li><li>二次木部は、樹皮から削除されているボルトの長手方向軸に沿ってこすることによりストレートエッジ、片面カミソリで収穫されます。組織の汚染を最小限に抑えるためにゴム手袋を着用してください。 </li><li>樹皮のセクションの内側に配置されている師部は、容易に剥離手動で収穫される。 </li><li>反応の木は、尊敬グラウンドで元の方向を示すために、スプレーペンキでそれらをマークした後、手足の下面から収集されます。 </li><li>手足は1〜2 mのボルトに切断し、反応の木の2つのタイプのおおよその位置に基づいて縦軸に沿って反対側に得点されています：反対の木（四肢の上部側）と圧縮あて材（底上肢の側）。樹皮は、反応の木材の各タイプをカバーする樹皮を一度に削除されることを除いて、上記のような手足から分離されている。二次木部や篩部は、前述のように回収し、液体窒素中に配置されます。 </li><li>このような針、茎頂や若い円錐のような他のサンプルは、、手で収穫するか、または必要に応じ剪定ばさみを使用して設定できます。 </li><li>液体窒素で凍結採取した試料は、顕著な袋または適切な容器に入れ、実験室に戻って出荷のためにドライアイスで梱包してください。 </li></ol>パート2：サンプルのフリーザーミル加工<ol><li>液体窒素でスペックス6850フリーザーミルタンクを記入し、研削バイアルのいずれかにインパクトバーを配置し、プレチルに液体窒素で満たす。液体窒素を捨て、バイアルにサンプルを追加。 </li><li>余分な液体窒素が製粉チャンバー内に残っていないとエンドキャップは、チャンバーを密封するために装着される前に、その過剰な窒素ガスが完全に排気されていることを確認します。 </li><li>キャリアと密接に研削バイアルを挿入します。 </li><li> 14の速度の設定で1分/サイクルの2サイクル用ミル木質サンプル。 </li><li>あらかじめ冷却され、液体窒素を少量含まれているビーカーに粉砕されたサンプル（木粉）を除去するために液体窒素冷却したスパチュラを使用してください。 </li><li>必要になるまで-80℃で貯蔵容器と所定の位置に液体窒素/サンプルスラリーを注ぐ。 </li></ol>パート3：RNA単離、1日目<ol><li> 50mLのキャップファルコンチューブにRNA分離バッファの20mlの代わりとし、400μLのβ-メルカプトエタノール、軽くボルテックスして、60℃の水浴中で熱を加える。 </li><li>各チューブに凍結組織の4gを追加します。フタをし、10秒間ボルテックスし、次いで手で強く振とう。 </li><li>チューブに等量のクロロホルムを追加し、穏やかに転倒混和。回転するホイール​​にチューブを置き、5分間転倒ミキシングが可能。 </li><li> 12,000（17200 × g）で5分間SS34固定アングルローターの回転数で50 mLのオークリッジチューブと遠心分離機に混合物をデカント。 </li><li>新鮮なオークリッジ管に水相を移し、クロロホルムの半分のボリュームを追加します。 </li><li> 1分間ボルテックスし、5分間回転するホイール​​に混和して。 5分間SS34固定アングルローターで12,000 rpmで（17200 × g）で遠心する。 </li><li>新鮮なオークリッジ管に水相を移し、クロロホルムの半分のボリュームを追加します。 1分間ボルテックス。 10分間、SS34固定アングルローターで12,000 rpmで（17200 × g）で遠心する。 </li><li> 50mLの高速ポリプロピレンチューブに水相を移す。 20分SS34固定アングルローターで10,000 RPM（11900 × g）で遠心する。 </li><li>デカントは50mlのファルコンチューブに上清と清の四分の一のボリュームを追加する10 M LiClをソリューション。 4で簡潔にボルテックスし、場所で一晩沈殿のためのC。 </li></ol>パート4：RNAの単離、2日目<ol><li>開始する前に65℃の水浴中で熱のSSTEバッファ。 </li><li> 4℃で30分間SS34固定アングルローターで11000回転（14450 × g）で遠心分離によってポリプロピレンのチューブ及びペレットRNAにLiClを沈殿させ、サンプルを注ぐ℃に</li><li>遠心分離後、オフ注ぐと液体を捨てる、と約1分間、キムワイプで試験管を反転。残りの上清をピペットで。 </li><li>徹底的にサンプルを混合するピペットを用いて加熱SSTEの800μLで各ペレットを再懸濁する。 2 mLのAmbion社のRNase - freeマイクロチューブに再懸濁したサンプルを移す。 </li><li>熱サンプルを65℃の完全な再懸濁を確保するために積極的なボルテックスに続いて2分間。 </li><li>各サンプルチューブに、フェノール - クロロホルム、PH8の等量を追加。 30秒間ボルテックス各サンプルを、その後3分間14,000 rpmで遠心でスピン</li><li>新しい2mLのはAmbion社のRNase - freeマイクロチューブに水相を移し、等量のクロロホルムを加える。 3分間14,000 rpmで遠心で30秒とスピン間ボルテックス各サンプルを。 </li><li>以前に2分間11,000 rpmでmicrofugingによって準備されているフェーズロックジェルチューブに水相を移す。クロロホルムの半分量を加え、穏やかに混合してピペット。 </li><li> 5分間、11,000 rpmで遠心分離し、新鮮な2mLのアンビオンRNaseフリーのマイクロチューブに水相を移す。 </li></ol>パート5：RNAの降水量とエタノールで洗浄<ol><li>水相に50μLの3.0 M酢酸ナトリウム、pH 4.8、1 mLの100％エタノールを加えます。 -80の渦と沈殿-20℃で30分間または一晩℃です。 </li><li>慎重にマイクロ4で30分間14,000 rpmでサンプル° C、そして上清を吸引。ペレットを乱さないでください。 </li><li> 1mLを-20 ° C 70％（v / v）エタノールでRNAペレットを洗浄してください。 1分間14,000 rpmで微量とエタノールを吸引除去する。 </li><li>ステップ5.3を繰り返します。 </li><li> 3-5分のためのベンチでチューブと空気乾燥ペレットを暴露する。 </li></ol>パート6：最終的な再懸濁および定量<ol><li> 100μLのDEPC処理水に各ペレットを再懸濁する。ボルテックスで混合し、氷上に置く前に2分間、65℃でチューブをインキュベートする。サンプルの再懸濁を確保するために必要に応じて繰り返します。 </li><li>希望と分光学的定量のために、10mMのトリス、pH 7.5の10倍希釈液50μLを加えた場合のサンプルのようなプール。 280分の260と230分の260の吸光度比はそれぞれ、一般的に2.1と2.2よりも大きいです。 60120μg/ gの凍結組織からのRNA単離収率の範囲。 </li><li> TAEバッファー中で1％アガロースゲル上で1.5〜2.5μgのRNAを実行してサンプルを分析する。より重要なサンプルについては、製造元の指示に従ってAgilent 2100バイオアナライザを用いてRNAを分析する。 </li></ol>代表的な結果： 木質試料で60〜120μg/ gの凍結組織とは異なる針葉樹の組織の範囲からのRNA単離収率は通常、70〜80グラム/ gの凍結組織の周りに降伏。 280分の260と230分の260の診断率は両方とも2.1よりも一般的に大きくなって、そしてRNAサンプルはそれぞれ、重要なフェノールまたは炭水化物の汚染がないことを良い指標です。反応ステップの染色をアガロースゲル電気泳動によって分析したサンプルは、25S、18S、および5S RNA（図1）の3つの明瞭なバンドを表示する必要があります。アガロースゲル上で18Sに28Sの化学量論を決定することは幾分主観的であり、そしてそのような実行中のゲルのための条件、染色、およびサンプルの負荷などの要因がすべて影響を及ぼす可能性があります。一般的には、28S：18S比が&gt; 1.5であることが表示されます。ただし、一部の針葉樹のサンプルは低い比率を持っている。例えば、Agilent 2100バイオアナライザ分析の後我々は、化学量論は1.2:1に近い方の異なる組織タイプから針葉樹のサンプルの複数のインスタンスを見てきました。このように、見かけの低い28S：18Sアガロースゲル電気泳動による化学量論は、必ずしも低品質のサンプルを示しているわけではありません。葉、茎、およびコーンのサンプルは、しばしば追加の明瞭なバンドが葉緑体リボソームRNAによる発表があります。サンプルウェルまたは高分子量のバンド（&gt; 8〜10キロバイト）から移行しない流します染色材料は、通常、ゲノムDNAのコンタミネーション（図2）を示している。 5Sバンドのまたは下近傍の減少リボソームバンドの染色または明白18Sの低分子量の汚れが&gt; 28Sの化学量論は、RNAの分解が（図3）が発生したことを示す良い指標です。 1.2から2.0にどこまで18S比：Agilent 2100バイオアナライザ電気泳動分析では、ベースラインが低く、18Sと28Sをもつ28SリボソームRNAに対応する主要なピークを持つ比較的滑らかでなければなりません。 AgilentのRNAの完全性番号（RIN）値は、RNAの品質の良い予測因子である可能性があり、マイクロアレイのターゲットの調製に使用するRNAの少なくとも7以上にする必要があります。 18S：図5は、28Sで明らかにしたように非常に高いベースラインと顕著な低下を持っている貧しい木部RNAプレップを示し、18S 1.4〜等しい比と8.6のRIN値：図4は、28Sと木部のRNAの典型的なAgilent 2100バイオ電気泳動図を示しています。 RA0.65〜3.4のRINの値に等しいチタン。 <img src="/files/ftp_upload/1751/1751fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 高品質な松のRNAの図1。アガロースゲル分析。レーン1、NEB 1キロバイトの標準は、レーン2は、特徴的なリボソーム28S、18S、そして5Sのバンドと明らかに28Sとテーダマツ二次木部からの典型的なトータルRNAの分離を示しています：18S比&gt; 1。 <img src="/files/ftp_upload/1751/1751fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> ゲノムDNAで汚染された松のRNAサンプルの図2。アガロースゲル分析。レーン1、NEB 1キロバイト標準、レーン2、ゲノムDNAのコンタミネーションを示す木部RNAサンプル。 <img src="/files/ftp_upload/1751/1751fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> ゲノムDNAとRNAの分解やコンタミネーションを示す松サンプルの図3。アガロースゲル分析。レーン1、NEB 1キロバイト標準、Lane2、ゲノムDNAのコンタミネーションと深刻なRNAの分解を示す木部RNAサンプル。 <img src="/files/ftp_upload/1751/1751fig4.jpg" alt="図4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図4"> 図4。木部のトータルRNAのAgilent 2100バイオアナライザ電気泳動図は、テーダマツの木部に記載された方法を用いて単離した。 28S：18S比は、RIN値は8.6に等しく、1.4に等しい<img src="/files/ftp_upload/1751/1751fig5.jpg" alt="図5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図5"> 図5。深刻な劣化とゲノムコンタミネーションを示す心尖先端トータルRNAのAgilent 2100バイオ電気泳動図。 28S：18S比はRINの値が3.4と等しい、0.65に等しい

<ol><li>Chang, S., Puryear, J., Cairney, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+efficient+method+for+extracting+RNA+from+pine+trees%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology+Reporter%22%5BJournal%5D)">A simple and efficient method for extracting RNA from pine trees.</a> Plant Molecular Biology Reporter. 11 (2), 113-116 (1993).</li>
<li>Lorenz, W. W., Yu, Y. S., Siműes, M., Dean, J. F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+the+Loblolly+Pine+PtGen2+cDNA+Microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Processing the Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray.</a> Journal of Visualized Experiments. 25, (2009).</li>
</ol>

針葉樹の種から高品質のRNAを得ることは木質の組織で検出されたフェノール及び多糖類化合物を高レベルで与えられる困難な作業になる場合があります。 Changらによって開発されたプロトコルを使用して起動。 （1）、我々はより厳密な抽出を発見し、様々な木質と針葉樹種の多種多様なサンプリング非木質組織から非常に高品質のトータルRNAの一貫性のある分離する可能性の手順をクリーンアップしている。このビデオは私達の修飾RNAの分離のプロトコルだけでなく、フィールドのコレクションと分離をRNAに前テーダマツのために使用される加工技術で撮影されたステップだけでなく、実証されています。これらの収穫と準備の手順では、RNAの質と総収量の両方を高めるために、フィールド収集したサンプルだけでなく、中のRNA分解を最小限に抑えるためにも重要です。最も著しく、我々は、RNAがPtGen2ぬかるみ松マイクロアレイ（2）に対するハイブリダイゼーションのためにマイクロアレイターゲットを調製するために使用される他の方法に比べてcDNA合成の収量を増加につながっているこの方法を用いて調製することを見出した。

<table><tbody><tr><td>RNA抽出バッファー</td><td></td><td></td><td>2% CTAB (hexadecyltrimethylammonium bromide), 2% PVP (polyvinyl pyrrolidinone; Mw 30-40,000), 100mM Tris-HCl (pH8.0), 25mM EDTA, 2.0M NaCl, 0.5g/L Spermidine</td></tr><tr><td>クロロフォーム</td><td>Fisher Scientific</td><td>C298-4</td><td></td></tr><tr><td>フェノール、Ultrapure</td><td>Invitrogen</td><td>15509-037</td><td></td></tr><tr><td>10M LiCl</td><td></td><td></td><td>DEPC処理水を用いて調製</td></tr><tr><td>SSTEバッファー</td><td></td><td></td><td>1M NaCl, 0.5% SDS, 10mM Tris-HCl (pH8.0), 1mM EDTA (pH8.0)</td></tr><tr><td>酢酸ナトリウム (NaOAc) 3M pH4.8</td><td></td><td></td><td>DEPC処理水を用いて調製</td></tr><tr><td>フェノール-クロロフォーム (pH8.0)</td><td></td><td></td><td>120mL フェノール, 160mL クロロフォームを0.5M Tris-Cl pH 8.0で複数回滴定して調製</td></tr><tr><td>Oak Ridge 高速遠心用テフロンチューブ</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>#05-562-16B</td><td></td></tr><tr><td>ポリプロピレン製 50mL 高速遠心チューブ</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>#05-562-10K</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon 滅菌済み キャップ付き 50mL 円錐型使い捨てチューブ</td><td>VWR international</td><td>#21008-939</td><td></td></tr><tr><td>Phase Lock Gel Heavy, 2mL</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>#2302830</td><td></td></tr><tr><td>Ambion RNaseフリー マイクロ遠心チューブ, 2mL</td><td>Ambion</td><td>#AM12425</td><td></td></tr></tbody></table>

ロボロリーパインからのrna分離の改良法（ p. taeda l.）及びその他の針葉樹種

An Improved Method of RNA Isolation from Loblolly Pine (P. taeda L.) and Other Conifer Species

このようなテーダマツ（のような特に針葉樹の種、マツ科のファミリーに属するものから分離された組織、<em&gt;テーダマツ</em&gt; L.）、RNAの精製を妨害するフェノール化合物と多糖類の高濃度が含まれています。これらの種から高品質のRNAの単離は、マイクロアレイや他のゲノム解析のために十分な品質のRNAを分離するために、複数の有機溶媒抽出のステップから構成されるRNAの分離のプロトコルのフィールドと雇用の厳格な組織の収集手順が必要です。フィールドで収集テーダマツのサンプルから高品質のRNAの分離は非常に結果を改善に挑戦、しかしいくつかの標準的な組織の変更やRNAの分離の手続きができます。サンプルが正常に特に大規模な収穫時に、フィールドから収集し、輸送されていない場合、一般的なRNA分解の程度が増加する。トータルRNAの収量はサンプルがwoodyの組織から来た場合は特に、分離をRNAに前に液体窒素の冷凍工場でサンプルを粉砕して大幅に増加することができます。これは主にこのようなフェノール化合物、および両方のほとんどの針葉樹種の木質組織からの抽出物中の高濃度で存在する多糖類などの酸化剤の存在、によるものです。削除しない場合、これらの汚染物質は、そのようなRNAの分解、低収量と低品質RNAサンプルでその結果としての問題、につながる以上運ぶことができる。フェノール化合物だけでなく、多糖類のキャリーオーバーは、また減らすか、完全に逆転写酵素または一般的なcDNA合成に使用される他のポリメラーゼの活性をなくすことができます。研究者が期待するなら、特に、c​​DNAライブラリーの世代の二本鎖cDNA合成のテンプレートとして使用される運命RNA、PCRや定量PCRのために、またはマイクロアレイターゲット材料の合成のための一本鎖cDNA合成は、最高品質のものでなければならない最適な結果を得るために。一般的に他の多くの植物種に用いるRNAの分離技術は、針葉樹のサンプルからこれらの汚染物質を除去するため、下流の操作に適したトータルRNAサンプルを得られない能力がしばしば不十分である。このビデオでは、篩部の収穫、二次木部、およびあて材の木部に、40年前の木の伐採をはじめ、針葉樹の組織のフィールドのコレクションのための方法を示しています。我々はまた、一貫して、その後の酵素的操作のための高品質のRNAをもたらしましたRNAの分離のプロトコルを示しています。

テーダマツから篩部および木部を含む多くの植物組織、（<em&gt;テーダマツ</em&gt; L.）、フェノール類およびRNA精製を妨害する多糖類の高レベルが含まれています。このプレゼンテーションでは、屋外栽培の組織やマイクロアレイや他のゲノム解析のための十分な品質のRNAの単離の収穫のためのテクニックを説明します。

ロボロリーパインからのRNA分離の改良法（ P. taeda L.）及びその他の針葉樹種

針葉樹、特にロブロリーパイン（Pinus taeda L.）などのマツ科に属する種の分離組織は、高濃度の...を含んでいる。

以下は、ジョージア大学およびワーネル林業・天然資源大学院の研究者によって作成されました。このデモンストレーションビデオでは、米国において林産物生産に最も重要な針葉樹種である、一般にロブロンパインとして知られる Pinus Teta からの木部および師部組織の採取、およびその後の RNA 分離について解説します。樹木（本例では樹齢40年の個体）を伐採した後、主幹を約 50 cm の長さのボルト状に切断します。次に、樹皮の剥離を容易にするため、チェーンソーを用いてボルトに沿って縦方向に数箇所切り込みを入れます。ハンマーとノミを使用して、樹皮が部分的に剥がれるまで持ち上げます。その後、流管組織を手で取り除き、樹皮セクションの内側から剥ぎ取り、直ちに液体窒素に浸漬させます。樹皮を除去した後、片刃のカミソリでボルト表面を削ることで、二次 xylem の薄い層を回収できます。水分を多く含む xylem 組織は、直ちに液体窒素に入れます。今回の採取では、主幹から枝を切断する前に、一般に圧縮材および対向材と呼ばれる反応材のサンプルも回収しました。まず、肢の向きにスプレー塗料で印を付け、肢の上部にある引張材（opposite wood）と下部にある圧縮材（compression wood）の2種類の組織が含まれる領域を特定できるようにします。樹皮の除去に際しては、まずチェーンソーを用いて圧縮材と引張材の境界線に沿って切り込みを入れ、主幹のボルトと同様に樹皮を除去します。ただし、反応材の種類に対応する領域の樹皮のみを除去します。採取される材は、任意のタイミングで除去されます。一般的に、これらの細い枝から大きな樹皮部分を除去することはより困難です。二次 xylem の反応材サンプルは、通常の二次 xylem と同様に、カミソリで削り取り、直ちに液体窒素に浸漬させる方法で採取します。圧縮材に特徴的な赤褐色の色調に注目してください。大木から複数のサンプルを採取し処理する場合、RNAの分解を抑制するために、各担当者が指定されたタスクを遂行し、すべての組織タイプを同時に採取することが重要です。液体窒素で凍結させたサンプルは、その後ラベル付きの保存袋に移され、研究室への輸送のためにドライアイス上に置かれます。最初のステップとして、Spec Model 68 50 フリーザーミルを使用して組織を粉砕します。乳鉢と乳棒で研磨する場合と比較して、この工程は液体窒素でサンプルの低温状態を維持しながら、木本組織サンプルのRNA抽出収量を大幅に向上させます。まず組織を手で細かく砕き、サンプルチャンバーに入れます。チャンバーをキャリアに挿入して固定し、サンプルを2分間ミル処理します。最終産物は粗い粉末状になります。RNA抽出プロトコルは2日間の工程で行います。1日目は、凍結組織2.5 gを65 °Cに加熱したRNA抽出バッファーに加えます。サンプルを激しく振盪して混合し、同量のクロロホルムを加えて、緩やかに転倒混和させることで再度サンプルを混合します。次に、試料を回転ホイールに載せて5分間回転させます。その後、試料を高速遠心分離用のテフロン製Oakridgeチューブに移し、SS 34ローターを用いて12,000 RPMで5分間遠心分離します。上層の水相分画を新しいチューブに回収し、0.5倍量のクロロホルムを加えます。サンプルを1分間ボルテックスし、再度回転ホイールに5分間置きます。2回目の遠心分離後、水層を再び50 mlの高速度ポリプロピレンチューブに分取し、10,000 RPMで20分間遠心分離します。残留した微粒子を除去するため、サンプルを50 mlのFalconチューブにデカンテーションし、サンプルの4分の1量に相当する10 molar 塩化リチウムを加えます。試料を振とうして混合し、4 °Cで一晩静置します。翌日、塩化リチウムで沈殿させた試料を、まず4 °C、11,000 RPMで30分間遠心分離します。上澄みを捨て、チューブをキムワイプの上に1分間倒立させます。過剰な液体を除去した後、視認できるはずのRNAペレットを、65 °Cに予熱した800 µLの高温SSTEバッファーで再懸濁します。ペレット全体が完全に溶解するように、ピペッティングを数回繰り返し、ペレットの周囲全体に行うようにしてください。次に、再懸濁したRNAを2 mL以上のRNAフリーマイクロ遠心チューブに移します。サンプルを65 °Cのウォーターバスで1〜2分間加熱し、その後ボルテックスにかけてサンプルが完全に再懸濁していることを確認します。必要に応じて、この操作を繰り返してください。次に、同量の緩衝フェノール・クロロホルムを加えます。サンプルを15〜20秒間ボルテックスし、14,000 RPMで3分間遠心分離します。水層を新しいマイクロ遠心チューブに回収し、同量を加えます。サンプルは、前回の抽出と同様にボルテックス処理およびマイクロ遠心分離を行います。最終的な有機抽出段階において、ロックゲルチューブをまず11,000 RPMで2分間マイクロ遠心分離します。次に、前段階の抽出で得られたRNAサンプルをフェーズロックゲルに加え、さらに半量分のクロロホルムを加え、ピペッティングで静かに混合します。その後、サンプルを11,000 RPMで5分間遠心分離し、水層のRNAサンプルを新しいAmbion RNA-freeマイクロ遠心チューブに回収します。次のステップでは、サンプルに1/10量分の3 M 酢酸ナトリウム (pH 4.8) と2量分の100% ethanolを加え、簡便なRNA沈殿を行います。サンプルをボルテックスし、-80 °Cのフリーザーに30分間短時間放置した後、4 °Cで30分間遠心分離します。上清を注意深く吸引し、小さな白いペレットを氷冷した70%エタノール 1 mLで洗浄して吸引します。最終的な吸引後、エタノール洗浄を繰り返します。チューブをベンチ上に5分間開けたままにして、残留エタノールを蒸発させます。RNAペレットを100 µLのDEPC処理水に懸濁し、ボルテックスおよび65 °Cでの加熱により再懸濁させます。必要に応じてこの操作を繰り返します。その後、サンプルの濃度を測定します。分光光度計を用いて262/280および262/230の比率を算出し、サンプル中のタンパク質および糖質の混入程度を推定します。1% AGROSゲル電気泳動を行い、ゲノムDNAの混入およびRNAの分解状態からサンプル品質を定性的に推定します。重要なサンプルの完全性については、Agilent 2100バイオアナライザーを用いてリボソーム28S/18S比およびRNA整合性番号（RIN）を測定し、さらに評価します。Loblolly pineからの組織サンプルの採取および全RNA抽出に関するビデオをご視聴いただき、ありがとうございました。本トレーニングビデオの撮影および制作は、以下の方々が担当されました。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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我々は、修正されたDIGを説明...

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シロイヌナズナ植物の葉の表面とアポプラストから細胞外RNAを単離するためのシンプルでありながら再現性の高い方法について説明します。...

シロイヌナズナロゼットを用いた葉表面とアポプラスドRNAの単離と解析の段階的ガイド

学ぶロボロリーパイン（Pinus taeda）のキシレムと師部組織からの高品質RNA抽出法。フェノール類や多糖類による阻害を克服し、ゲノム解析に適したRNAを分離する実践的な技術を解説します。

ロボロリーパインからのRNA分離の改良法（ P. taeda L.）及びその他の針葉樹種

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