Name: Une seule unité In vivo Enregistrements à partir du chiasma optique du Rat (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-02T15:15:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Apprenez l'enregistrement in vivo de potentiels d'action depuis les cellules ganglionnaires rétiniennes chez le rat anesthésié. Cette technique utilise des électrodes en verre teintées au tungstène pour obtenir des signaux de haute qualité.

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Nous remercions le Dr Dan vert pour fournir un apport technique lors du développement de ces techniques expérimentales. Ce travail a été soutenu par des subventions du NIH R01-EY016849A et la famille Smith bourse de nouveau.

Partie I: Fabrication de tungstène-en-verre Électrodes <ol><li> Un anneau de graphite est placé dans un bécher rempli d&#39;une solution concentrée de nitrate de sodium (0.71g/mL) et d&#39;hydroxyde de potassium (0.34g/mL) dissous dans l&#39;eau 1, et le bécher est placé sous le bras de couture d&#39;une machine à coudre modifiées . </li><li> Fils de tungstène (0,5 mm de diamètre, longueur 6cm) est enregistrée au bras de couture afin qu&#39;il soit partiellement immergé (1-2cm) en solution. </li><li> 2V sont appliquées à travers le fil de tungstène en attachant un fil positif à la branche de couture et d&#39;un fil négatif à la bague de graphite. </li><li> La machine à coudre est allumé et le fil de tungstène est plongé dans une solution de façon répétitive à un taux de ~ 4Hz pendant 2 min, qui grave le métal par électrolyse d&#39;une pointe acérée. </li><li> Le fil gravé est placé sur un micromanipulateur manuel et les points alignés sous la direction microscopique (grossissement 40x) avec l&#39;arbre d&#39;une pipette en verre (0,25 OD, 0.175mm ID) tiré d&#39;un bout 1mm avec un extracteur de verre. Pour éviter tout mouvement pendant l&#39;insertion de fil, le verre est temporairement fixé à la platine du microscope avec du mastic. </li><li> Le fil est soigneusement avancés dans l&#39;extrémité unpulled du verre, au fond du puits, et par l&#39;ouverture 1 um Un petit morceau de verre est vu à rompre la pointe dans la vidéo, indiquant un ajustement serré du tungstène dans le verre. Le fil doit s&#39;étendre autour de 5-10mm au-delà de la pointe pour les enregistrements de la fibre optique chez le rat. </li><li> Cyanoacrylate est appliquée à la fin unpulled du verre et après le durcissement de l&#39;impédance électrique est mesurée, lorsque les électrodes 1MOhm généralement les meilleurs résultats. </li></ol> Partie II: Configuration stéréotaxique et enregistrements train de Spike <ol><li> Le système d&#39;affichage de relance est illustrée dans la vidéo, avec l&#39;appareil de stéréotaxie et Microdrive pour le positionnement et l&#39;abaissement de l&#39;électrode dans le cerveau. </li><li> Pour effectuer la rétine enregistrements train de pic le rat est anesthésié et plus tard paralysé. Les procédures standard (non illustrée) sont utilisés pour l&#39;insertion d&#39;une canule chirurgicale veine fémorale pour la livraison de drogue et une trachée (Y-tube) une canule pour la ventilation mécanique pendant la paralysie. Les expériences sont de terminal pour l&#39;animal. </li><li> Après des procédures préparatoires, l&#39;animal est placé sur la couverture chauffante et la tête est fixe en position stéréotaxique, telle que définie par l&#39;atlas du cerveau de rat 2, avec l&#39;oreille et bars dent. </li><li> La sonde rectale est inséré, qui contrôle la couverture chauffante via une unité de contrôle homéothermes qui maintient la température du corps à 37 ° C. </li><li> Aiguilles métalliques sont utilisés comme conduit pour mesurer l&#39;électrocardiogramme et moniteur de fréquence cardiaque. </li><li> La peau est ouvert sur le dessus du crâne et l&#39;intersection des plaques crâne (bregma) est exposée. Une trame transversale conçu sur mesure est mis en place, un cercle est marqué sur le crâne autour begma à travers un trou dans la traverse, et la barre transversale est temporairement retiré. </li><li> Le système de stéréotaxie est calibré par le positionnement de l&#39;aiguille de guidage sur bregma. Un trou de 5 mm est foré dans le crâne à l&#39;endroit marqué et l&#39;os est enlevée, exposant le cerveau. Un mince anneau de mastic est placé autour de l&#39;ouverture dans le crâne pour former un joint autour du trou dans la traverse, qui est remis en place. </li><li> Si l&#39;animal a été à un avion stable de l&#39;anesthésie pendant un certain temps, il est injecté avec paralytique afin d&#39;empêcher les mouvements des yeux lors de la collecte des données. Après arrêt de la respiration de l&#39;animal est ventilé mécaniquement. Un programme personnalisé pistes paramètres de ventilation et physiologiques à travers l&#39;expérience et l&#39;expérimentateur informe si des mesures compensatoires sont nécessaires devraient tous aller à l&#39;extérieur des paramètres des niveaux normaux. </li><li> L&#39;aiguille guide est backloaded avec l&#39;électrode de tungstène et descendu dans le cerveau. Après la pénétration du cerveau le trou barre est remplie avec de l&#39;agar (non représenté), et l&#39;assemblée microdrive est serrée sur la barre transversale pour la stabilité mécanique. L&#39;électrode de tungstène est alors lentement avancé (2μm/sec) l&#39;aiguille guide jusqu&#39;à la pointe est d&#39;environ 8-9mm dessous du crâne, où le chiasma optique est situé. </li><li> Trains de Spike appartenant à des cellules ganglionnaires de la rétine sont identifiés par leur réponse à l&#39;entrée visuelle. Après isolement d&#39;une seule fibre optique le champ récepteur de la cellule enregistrée est mappé dans l&#39;espace visuel et ses propriétés de réponse sont caractérisés avec des réseaux à la dérive ou d&#39;autres motifs d&#39;intérêt visuel. La stabilité du système permet unitaire des enregistrements de plusieurs heures 3. </li></ol> Matériaux Adulte Brown-Norway rats (250-400g) ont été achetés auprès d&#39;un fournisseur commercial et logés sous un réglementée (12/12) cycle lumière / obscurité. L&#39;anesthésie a été induite par une injection intrapéritonéale de chlorhydrate de kétamine et de xylazine (70 et 2 mg / kg, respectivement, Henry Schein Inc) et maintenu pour la durée de l&#39;expertiseiment avec une perfusion intraveineuse de kétamine et de xylazine (30 et 1 mg / kg / h) mélangé avec du dextrose, du sérum physiologique, et triéthiodure gallamine (40 mg / kg / h, Fischer Inc) par un cathéter (0,13 mm OD, petites pièces Inc ) dans la veine fémorale droite. Gallamine est inclus dans le mélange de paralyser les mouvements des yeux. Le débit de perfusion de la pompe (WPI Inc) a été ajusté au besoin pour maintenir un avion stable de l&#39;anesthésie telle qu&#39;évaluée par le rythme cardiaque et variabilité de la pression artérielle. Après la paralysie, l&#39;animal a été ventilé mécaniquement (Harvard Apparatus, modèle 683) à travers une canule trachéale à 60-80 respirations / min (2cc volume), avec le taux ajusté de façon à maintenir en fin d&#39;expiration de CO 2 mesurées avec une ligne en- capnomètre (Novametrix Inc, modèle 710Sp) à 30%. La température corporelle a été réglementé par un système de contrôle de couverture homéothermes (Harvard Apparatus Inc.) La température du corps, en fin d&#39;expiration de la fréquence cardiaque de CO 2, et la pression artérielle ont été constamment suivis tout au long de l&#39;expérience par un programme LabVIEW. Les stimuli visuels étaient présentés sur un Sony Multiscan 17e moniteur CRT (moyenne de luminance de 30 cd / m 2) fonctionnant à 100 Hz avec une résolution de 800x600 pixels. L&#39;acquisition des données et de sortie de moniteur ont été contrôlés avec un logiciel personnalisé écrit en Matlab et LabView en conjonction avec un processeur d&#39;image vidéo (Cambridge Research Systems Inc, Bits + +) et la boîte à outils Psychophysique 4. L&#39;animal considéré l&#39;affichage de relance (40,4 x 30,2 cm) à une distance de 16,5 cm grâce à des lentilles de contact (Ocular Instruments Inc), et une solution ophtalmique a été appliquée périodiquement pendant l&#39;expérience de garder les yeux humides. Le champ visuel accessible à la stimulation a été maximisée par montage inversé de l&#39;animal dans un appareil stéréotaxique (Stoelting Co) 14cm élevée au-dessus de la surface d&#39;une table flottante (TMC Inc) et réglage du moniteur sur un traîneau spécialement conçus qui se mouvait sur la table le long un arc de ± 100 ° sur le nez. Cela a fourni un champ d&#39;affichage repositionnable qui s&#39;étendait de 60 degrés au-dessus et 35 ci-dessous deg niveau des yeux et de ± 42 ° latéralement à partir du centre de l&#39;écran. Electodes tungstène ont été fabriqués avec du fil obtenu à partir de petites pièces Inc et personnalisée en verre borosilicate obtenus à partir de Friedrich et Dimmock Inc Une norme micropippete extracteur (Sutter Instruments, modèle P-97) a été utilisé pour la forme la pointe de verre. Le testeur d&#39;impédance d&#39;électrode a été acheté par Bak-Electronics. Les électrodes ont été avancées avec un système motorisé Microdrive (Newport Inc, StepperMike). Électrocardiogramme et les signaux du nerf optique ont été amplifiés et filtrés avec un amplificateur multiélectrodes entrée haute impédance (FHC Inc, X-Cell 3x4). Battements de cœur ont été détectés avec un discriminateur de fenêtre (WPI Inc, modèle 121). Potentiels d&#39;action nerveuses ont été détectés et horodatés avec une résolution 0.1ms par un discriminateur numériques pic (FHC Inc, APM). Le pic a été fermée discriminateur par un signal de déclenchement du processeur d&#39;image vidéo, de sorte que les temps de pic ont été enfermés au stimulus.

<ol><li>Levick, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Another+tungsten+microelectrode%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Biol+Eng%22%5BJournal%5D)">Another tungsten microelectrode.</a> Med Biol Eng. 10 (4), 510-515 (1972).</li>
<li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+rat+brain+in+stereotaxic+coordinates%22">The rat brain in stereotaxic coordinates</a>. , Fourth Edition, Academic Press. London, UK. (1998).</li>
<li>Freeman, D. K., Heine, W. F., Passaglia, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+maintained+discharge+of+rat+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Vis+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The maintained discharge of rat retinal ganglion cells.</a> Vis Neurosci. 25 (4), 535-548 (2008).</li>
<li>Brainard, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+psychophysics+toolbox%5BTitle%5D)+AND+%22Spat+Vis%22%5BJournal%5D)">The psychophysics toolbox.</a> Spat Vis. 10, 433-436 (1997).</li>
</ol>

Toutes les procédures expérimentales ont été approuvés par le soin des animaux et du Comité institutionnel utilisation à l&#39;Université de Boston.

Enregistrements de fibre optique sont une approche intéressante pour aborder les questions d&#39;expérimentation sur l&#39;encodage et la transmission des informations rétiniennes qui nécessitent un oeil intact. Par ailleurs, les propriétés de signalisation des deux yeux peuvent être étudiés dans pratiquement le même état physiologique si l&#39;électrode est placée dans le chiasma ou des voies où l&#39;activité des croisés et décroisés fibres du nerf optique peuvent être enregistrés avec un taux de pénétration seule éle...

une seule unité in vivo enregistrements à partir du chiasma optique du rat

Single-unit In vivo Recordings from the Optic Chiasm of Rat

Informations sur le monde visuel est transmis au cerveau dans les séquences de potentiels d&#39;action dans les axones des cellules ganglionnaires rétiniennes qui forment le nerf optique.<em&gt; In vivo</em&gt; Enregistrements de trains ganglionnaires pic de cellules dans plusieurs modèles animaux ont révélé une grande partie de ce qu&#39;on sait sur la façon dont le début des processus système visuel et encode l&#39;information visuelle. Cependant, ces enregistrements ont été rares dans l&#39;un des modèles animaux les plus communs, le rat, peut-être à cause de la difficulté à détecter les pics tiré par les axones de petit diamètre. Les nombreux modèles maladie de la rétine des rats motiver une nécessité pour caractériser les propriétés fonctionnelles des cellules ganglionnaires sans déranger l&#39;œil, comme avec intraoculaire ou<em&gt; In vitro</em&gt; Enregistrements. Ici, nous démontrons une méthode d&#39;enregistrement des trains ganglionnaires pic de cellules à partir du chiasma optique du rat anesthésié. Nous montrons d&#39;abord comment fabriquer de tungstène, en verre électrodes qui peut ramasser l&#39;activité électrique du simple axones des cellules ganglionnaires chez le rat. Les électrodes surpasser tous les commerciaux que nous avons essayé. Nous avons ensuite illustrer notre système conçu sur mesure pour la stéréotaxie<em&gt; In vivo</em&gt; Visuelle neurophysiologie expériences et nos procédures pour la préparation des animaux et le placement des électrodes fiables et stables dans le chiasma optique.

Cellules ganglionnaires de la rétine transmettent l&#39;information visuelle de l&#39;œil au cerveau avec des séquences de potentiels d&#39;action. Ici, nous montrons comment enregistrer les potentiels d&#39;action des cellules ganglionnaires de simples<em&gt; In vivo</em&gt; À partir de rats anesthésiés.

Une seule unité In vivo Enregistrements à partir du chiasma optique du Rat

Les informations relatives au monde visuel sont transmises au cerveau sous forme de séquences de potentiels d'action dans les axones des cellules ganglionnaires rétiniennes qui constituent le nerf optique...

Nous allons démontrer aujourd'hui un système d'enregistrement que nous avons mis au point pour enregistrer in vivo au niveau du chiasma optique du rat. Ce type d'enregistrement est très rare chez le rat, en partie parce que les axones des cellules ganglionnaires rétiniennes qui constituent le nerf optique sont très fins, ce qui rend difficile l'enregistrement à partir de cellules individuelles. Étant donné que le rat est un modèle animal courant pour l'étude de la dégénérescence rétinienne, ces enregistrements peuvent fournir de nombreuses informations utiles. La clé de la réussite de ces enregistrements réside dans les électrodes en verre tungstène que nous avons conçues, dotées d'une pointe longue et fine, permettant d'enregistrer des potentiels d'action à partir d'axones de petit diamètre avec un rapport signal sur bruit élevé.Nous allons vous guider à travers le processus de fabrication de ces électrodes et vous montrer comment installer l'animal sur l'appareil stéréotaxique, puis nous vous présenterons un exemple d'enregistrement de trains de pics provenant d'une seule cellule ganglionnaire. Trois principaux équipements sont nécessaires pour fabriquer les électrodes : un tireu

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JoVE Journal

Neuroscience

Neurosciences

Nous décrivons une méthode relativement simple de transretinal électrorétinogramme (ERG) pour l'obtention des enregistrements photoresponses bâtonnets et des cônes de la rétine de la souris intacte. Cette approche tire profit du bloc de la transmission synaptique de photorécepteurs à isoler leurs réponses claires et de les enregistrer en utilisant des électrodes sur le terrain placé à travers le plat isolé monté sur la rétine.

Transretinal Recordings ERG de rétine de souris: Rod et Photoresponses Cône

Cette vidéo montre la préparation d’un modèle de rat pour étudier la santé de la rétine et l’intégrité des voies visuelles. Le potentiel évoqué visuel, la référence d’électrorétinographie et les électrodes actives sont connectées au rat, puis alignées sur la plate-forme avec le rat devant le bol de Ganzfeld pour un éclairage rétinien uniforme et fermées la cage de Faraday pour éviter les interférences externes.

Préparation d’un modèle de rat pour évaluer l’intégrité de la voie visuelle à l’aide d’une configuration électrophysiologique

Cette vidéo montre la procédure détaillée de préparation d’un rat anesthésié pour les enregistrements électrophysiologiques de l’activité cérébrale à partir de plusieurs sites. Le cuir chevelu est disséqué pour accéder au crâne, et des trous sont percés à des endroits précis pour installer et fixer les électrodes. Des électrodes à microfils de tungstène sont ensuite insérées à l’endroit ciblé pour enregistrer les données.

Enregistrements électrophysiologiques in vivo d’activités cérébrales provenant de plusieurs sites chez le rat

Cette vidéo montre le processus de mesure des potentiels évoqués visuels ou VEP chez un rat anesthésié adapté à l'obscurité avec des électrodes crâniennes préimplantées, qui enregistrent les signaux électriques du cortex visuel du cerveau en réponse à des stimuli lumineux.

Enregistrement de potentiels évoqués visuels via les électrodes du crâne dans un modèle de rat

Cette vidéo montre comment enregistrer l’électrorétinogramme (ERG) et le potentiel évoqué visuel (VEP) chez un rat conscient. Le rat, avec des électrodes implantées chirurgicalement, est d’abord adapté à l’obscurité. Après avoir appliqué des gouttes dilatantes, l’animal est placé dans une contention et positionné dans un bol Ganzfeld. Les signaux ERG et VEP sont ensuite enregistrés.

Enregistrement d’un électrorétinogramme et d’un potentiel évoqué visuel chez un rat

Ex vivo ERG peut être utilisé pour enregistrer l’activité électrique des cellules rétiniennes directement à partir de rétines intactes isolées d’animaux ou d’humains. Nous démontrons ici comment les systèmes ERG in vivo courants peuvent être adaptés aux enregistrements ERG ex vivo afin de disséquer l’activité électrique des cellules rétiniennes.

Simultané<em&gt; Ex vivo</em&gt; Tests fonctionnels de deux rétines par<em&gt; In vivo</em&gt; Système Électrorétinogramme

La démyélinisation focale est induite dans le nerf optique par micro-injection de lysolécithine. Les potentiels évoqués visuels sont enregistrés via des électrodes crâniennes implantées sur le cortex visuel pour examiner la conduction du signal le long de la voie visuelle in vivo. Ce protocole détaille les procédures chirurgicales sous-jacentes à l’implantation d’électrodes et à la micro-injection de nerf optique.

Enregistrement Potentiel évoqué visuel dans un modèle de rat of Experimental Optic Nerve démyélinisation

Ce protocole décrit la mesure simultanée de l’électrorétinogramme et des potentiels évoqués visuels chez des rats anesthésiés.

Enregistrement simultané de Électrorétinographie et potentiels évoqués visuels chez des rats anesthésiés

Nous montrons les procédures d'implantation et d'enregistrement chirurgicales pour mesurer des signaux électrophysiologiques visuels de l'oeil (électrorétinogramme) et le cerveau (visuel potentiel évoqué) chez des rats conscients, ce qui est plus analogue à la condition humaine où les enregistrements sont effectués sans anesthésie confond.

Implantation et enregistrement de Wireless Électrorétinogramme et potentiel évoqué visuel chez des rats conscients

Ici, nous décrivons des méthodes de manipulation optogénétique de types particuliers de neurones pendant la surveillance des états de sommeil/éveil chez les souris, présentant nos travaux récents sur le noyau de lit de la stria terminalis comme exemple.

Manipulation optogénétique des circuits neuronaux pendant la surveillance des états de sommeil/éveil chez les souris

Ce protocole décrit une méthode permettant d’obtenir in vivo des enregistrements de neurones uniques à haute densité à partir du tronc cérébral de souris fixées à la tête. Cette approche est déployée pour mesurer le potentiel d’action des neurones dans le gris périaqueducal ventrolatéral - une région du tronc cérébral inactive pendant le sommeil paradoxal - avant et pendant l’anesthésie générale.

Enregistrements aigus à une unité et à plusieurs électrodes du tronc cérébral de souris fixées à la tête

Apprenez l'enregistrement in vivo de potentiels d'action depuis les cellules ganglionnaires rétiniennes chez le rat anesthésié. Cette technique utilise des électrodes en verre teintées au tungstène pour obtenir des signaux de haute qualité.

Une seule unité In vivo Enregistrements à partir du chiasma optique du Rat

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