Name: Singola unità In vivo Registrazioni dal chiasma ottico di Rat (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-02T15:15:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Impara a registrare potenziali d'azione da singole cellule gangliari retiniche in vivo nel ratto anestetizzato utilizzando elettrodi in vetro al tungsteno. Questa tecnica innovativa consente registrazioni ad alto rapporto segnale-rumore.

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Ringraziamo il dottor Dan Green per la fornitura di input tecnici durante lo sviluppo di queste tecniche sperimentali. Questo lavoro è stato sostenuto da NIH di Grant R01-EY016849A e la famiglia Smith New Investigator Award.

Parte I: Fabbricazione di tungsteno-in-vetro Elettrodi <ol><li> Un anello di grafite è posto in un bicchiere riempito con una soluzione concentrata di nitrato di sodio (0.71g/mL) e idrossido di potassio (0.34g/mL) disciolto in acqua 1 e la coppa è posta sotto il braccio di cucitura di una macchina da cucire modificato . </li><li> Filo di tungsteno (0,5 mm di diametro, lunghezza 6cm) è registrato al braccio di cucitura in modo che sia parzialmente immersa (1-2cm) in soluzione. </li><li> 2V vengono applicati attraverso il filo di tungsteno collegando un cavo positivo al braccio da cucire e un conduttore negativo al anello in grafite. </li><li> La macchina da cucire è accesa e il filo di tungsteno viene immerso ripetutamente in soluzione ad una velocità di circa 4 Hz per 2 minuti, che incide elettroliticamente il metallo a una punta acuminata. </li><li> Il filo inciso è posto su un micromanipolatore manuale e il punto allineati sotto la guida microscopica (ingrandimento 40x) con l&#39;albero di una pipetta di vetro (0,25 mm OD, ID 0,175 millimetri) tirato a una punta 1mm con un estrattore di vetro. Per evitare qualsiasi movimento durante l&#39;inserimento del filo, il vetro è temporaneamente fissata al palco microscopio con stucco. </li><li> Il filo è attentamente avanzate nel fine unpulled del vetro, giù l&#39;albero, e attraverso l&#39;apertura 1μm Un piccolo pezzo di vetro è visto di troncare la punta nel video, che indica una perfetta aderenza del tungsteno nel bicchiere. Il filo dovrebbe estendere a circa 5-10mm oltre la punta per le registrazioni in fibra ottica di ratto. </li><li> Cianoacrilato è applicato alla fine unpulled del vetro e dopo l&#39;indurimento l&#39;impedenza elettrica è misurata, in cui elettrodi 1M in genere funzionano meglio. </li></ol> Parte II: installazione e Stereotassica Recordings Train Spike <ol><li> Il sistema di visualizzazione stimolo è illustrato nel video, insieme con l&#39;apparato stereotassico e microdrive per il posizionamento e abbassare l&#39;elettrodo nel cervello. </li><li> Per eseguire le registrazioni della retina treno punta il topo è anestetizzato e poi paralizzato. Procedure standard (non illustrato) sono utilizzati per l&#39;inserimento di una cannula chirurgica vena femorale per la consegna della droga e un tracheale (Y-tube) cannula per la ventilazione meccanica durante la paralisi. Gli esperimenti sono terminali per l&#39;animale. </li><li> Dopo le procedure preliminari, l&#39;animale viene posto sulla coperta di riscaldamento e la testa è fissata in posizione stereotassica, come definito dal cervello di ratto atlante 2, con l&#39;orecchio e bar dente. </li><li> La sonda rettale è inserito, che controlla la coperta di riscaldamento tramite una unità di controllo homeothermic che mantiene la temperatura corporea a 37 ° C. </li><li> Aghi di metallo vengono utilizzate come porta per misurare l&#39;elettrocardiogramma e cardiofrequenzimetro. </li><li> La pelle è aperto sulla parte superiore del cranio e l&#39;intersezione di lastre del cranio (bregma) è esposto. Una cornice personalizzata traversa si trova in posto, un cerchio è segnato sul cranio intorno begma attraverso un foro nella traversa, e la traversa viene temporaneamente rimosso. </li><li> Il sistema stereotassico è calibrato con il posizionamento dell&#39;ago guida nel bregma. A 5 mm foro è perforato il cranio nella posizione indicata e l&#39;osso è rimossa, esponendo il cervello. Un anello sottile di stucco è posizionato intorno all&#39;apertura nel cranio per formare un sigillo attorno al foro della traversa, che viene riportato in posizione. </li><li> Se l&#39;animale è stato in un piano stabile di anestesia per un po &#39;, viene iniettato con paralitico al fine di prevenire i movimenti oculari durante la raccolta dei dati. Dopo respiro si ferma l&#39;animale è a ventilazione meccanica. Un programma personalizzato tracce parametri di ventilazione e fisiologica per tutto l&#39;esperimento e informa lo sperimentatore se l&#39;azione di compensazione è necessario alcun parametro dovrebbe uscire livelli normali. </li><li> L&#39;ago guida è backloaded con l&#39;elettrodo di tungsteno e chino nel cervello. Dopo la penetrazione cervello traversa il foro è pieno di agar (non mostrato), e l&#39;assemblea microdrive è bloccato per la traversa per la stabilità meccanica. L&#39;elettrodo di tungsteno è poi lentamente avanzato (2μm/sec) l&#39;ago guida fino a quando la punta è di circa 8-9mm sotto il cranio, dove si trova il chiasma ottico. </li><li> Treni di impulsi appartenenti a cellule gangliari della retina sono identificati dal loro risposta a un input visivo. Su isolamento di una singola fibra ottica del campo recettivo della cellula registrato è mappato nello spazio visivo e le sue proprietà di risposta sono caratterizzate da grate fisse o altri modelli visivi di interesse. La stabilità del sistema permette di singole unità registrazioni di alcune ore 3. </li></ol> Materiale Adulti Brown-Norvegia ratti (250-400g) sono stati acquistati da un fornitore commerciale e alloggiati sotto un mercato regolamentato (12/12) ciclo luce / buio. L&#39;anestesia è stata indotta con una iniezione intraperitoneale di cloridrato di ketamina e xilazina (70 e 2 mg / kg, rispettivamente, Henry Schein Inc) e mantenuta per la durata della compeanche provare una infusione endovenosa di ketamina e xilazina (30 e 1 mg / kg / ora) miscelato con destrosio, soluzione salina, e triethiodide gallamine (40 mg / kg / ora, Fischer Inc) attraverso un catetere (0,13 mm OD, parti piccole Inc ) nella vena femorale destra. Gallamine è incluso nella miscela per paralizzare i movimenti degli occhi. La velocità di infusione della pompa (WPI Inc) è stato regolato secondo necessità per mantenere un aereo stabile di anestesia valutata mediante la frequenza cardiaca e della pressione arteriosa variabilità. Dopo la paralisi, l&#39;animale era in ventilazione meccanica (Harvard Apparatus, Modello 683) attraverso una cannula tracheale a 60-80 atti / min (2 cc di volume), con un tasso aggiustato in modo da mantenere la end-tidal CO 2 misurata con un filtro in linea capnometro (Novametrix Inc, Modello 710Sp) al 30%. La temperatura corporea è regolata tramite un sistema di controllo homeothermic coperta (Harvard Apparatus Inc). Temperatura corporea, end-tidal cuore CO 2, il tasso, e la pressione sanguigna sono stati continuamente monitorati per tutta l&#39;esperimento con un programma LabVIEW. Stimoli visivi sono stati presentati in una Multiscan Sony 17e monitor CRT (media luminanza di 30 cd / m 2) in esecuzione a 100 Hz con una risoluzione di 800x600 pixel. Acquisizione dati e di un&#39;uscita monitor sono stati controllati con il software personalizzato scritto in Matlab e LabView in combinazione con un processore di immagini video (Cambridge Research Systems Inc, Bits + +) e la Psicofisica Toolbox 4. L&#39;animale visto il display stimolo (40,4 x 30,2 cm) a una distanza di 16,5 centimetri attraverso lenti a contatto (Ocular Instruments Inc), e la soluzione oftalmica è stata applicata periodicamente durante l&#39;esperimento di tenere gli occhi umidi. Il campo visivo accessibile alla stimolazione è stato massimizzato il montaggio invertire l&#39;animale in un apparato stereotassico (Stoelting Co) 14 centimetri elevata sopra la superficie di una tavola galleggiante (TMC Inc) e impostare il monitor su un design personalizzato slitta che si muoveva sul tavolo lungo arco di ± 100 gradi circa il naso. Questo ha fornito un campo riposizionabile schermo che si estendeva per 60 ° sopra e 35 gradi sotto il livello degli occhi e ± 42 gradi lateralmente dal centro del monitor. Electodes tungsteno sono stati fabbricati con fili ottenuti da piccole parti Inc e personalizzate in vetro borosilicato ottenuti da Friedrich e Dimmock Inc. Uno standard micropippete estrattore (Sutter Instruments, modello P-97) è stato utilizzato per modellare la punta di vetro. Il tester impedenza elettrodo è stato acquistato da Bak-Electronics. Elettrodi sono stati avanzati con un microdrive motorizzato (Newport Inc, StepperMike). Elettrocardiogramma ed i segnali del nervo ottico sono stati amplificati e filtrati con un amplificatore ad alta impedenza di ingresso multielectrode (FHC Inc, X-Cell 3x4). Battiti cardiaci sono stati rilevati con un discriminatore finestra (WPI Inc, Modello 121). Potenziali d&#39;azione del nervo sono stati rilevati e marcati temporalmente con risoluzione 0,1 ms da un picco digitale discriminatore (FHC Inc, APM). Il discriminatore mediati dal picco è stato un segnale di trigger dal processore di immagini video in modo che i tempi di picco sono stati bloccati allo stimolo.

<ol><li>Levick, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Another+tungsten+microelectrode%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Biol+Eng%22%5BJournal%5D)">Another tungsten microelectrode.</a> Med Biol Eng. 10 (4), 510-515 (1972).</li>
<li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+rat+brain+in+stereotaxic+coordinates%22">The rat brain in stereotaxic coordinates</a>. , Fourth Edition, Academic Press. London, UK. (1998).</li>
<li>Freeman, D. K., Heine, W. F., Passaglia, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+maintained+discharge+of+rat+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Vis+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The maintained discharge of rat retinal ganglion cells.</a> Vis Neurosci. 25 (4), 535-548 (2008).</li>
<li>Brainard, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+psychophysics+toolbox%5BTitle%5D)+AND+%22Spat+Vis%22%5BJournal%5D)">The psychophysics toolbox.</a> Spat Vis. 10, 433-436 (1997).</li>
</ol>

Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale Usa presso la Boston University.

Registrazioni in fibra ottica sono un approccio interessante per affrontare questioni sperimentali sulla codifica le informazioni della retina e la trasmissione che richiedono un occhio intatto. Inoltre, le proprietà di segnalazione di entrambi gli occhi possono essere studiati in praticamente nello stesso stato fisiologico se l&#39;elettrodo è posizionato nel chiasma ottico o delle vie dove l&#39;attività di incrociati e non incrociati fibre del nervo ottico possono essere registrati con una penetrazione del singolo el...

singola unità in vivo registrazioni dal chiasma ottico di rat

Single-unit In vivo Recordings from the Optic Chiasm of Rat

Informazioni sul mondo visivo viene trasmesso al cervello in sequenze di potenziali d&#39;azione negli assoni delle cellule gangliari retiniche che formano il nervo ottico.<em&gt; In vivo</em&gt; Le registrazioni dei treni delle cellule gangliari picco in diversi modelli animali hanno rivelato molto di ciò che si sa su come i primi processi sistema visivo e codifica le informazioni visive. Tuttavia, tali registrazioni sono stati rari in uno dei modelli animali più comuni, il ratto, probabilmente a causa di difficoltà nel rilevare picchi sparati da assoni di piccolo diametro. I molti modelli delle malattie della retina coinvolgono ratti motivare la necessità di caratterizzare le proprietà funzionali delle cellule gangliari senza disturbare l&#39;occhio, come con intraoculare o<em&gt; In vitro</em&gt; Registrazioni. Qui, dimostrare un metodo per i treni delle cellule gangliari registrazione picco dal chiasma ottico del ratto anestetizzato. Per prima cosa mostreremo come fabbricare tungsteno-in-vetro elettrodi in grado di raccogliere l&#39;attività elettrica di singoli assoni delle cellule gangliari nel ratto. Gli elettrodi superare tutti quelli commerciali che abbiamo provato. Abbiamo poi illustrare il nostro progettato su misura del sistema stereotassico per<em&gt; In vivo</em&gt; Visivo esperimenti neurofisiologia e le nostre procedure per la preparazione degli animali e il posizionamento dell&#39;elettrodo affidabile e stabile nel chiasma ottico.

Cellule gangliari della retina trasmettere informazioni visive dall&#39;occhio al cervello con sequenze di potenziali d&#39;azione. Qui, dimostriamo come registrare le potenziali d&#39;azione delle cellule gangliari singolo<em&gt; In vivo</em&gt; Da topi anestetizzati.

Singola unità In vivo Registrazioni dal chiasma ottico di Rat

Le informazioni relative al mondo visivo vengono trasmesse al cervello sotto forma di sequenze di potenziali d'azione negli assoni delle cellule gangliari retiniche, che costituiscono il nervo ottico...

Illustreremo oggi un sistema di registrazione da noi sviluppato per effettuare registrazioni in vivo dal chiasma ottico del ratto. Questi tipi di registrazione sono stati molto rari nel ratto, in parte perché gli assoni delle cellule gangliari retiniche che costituiscono il nervo ottico sono molto piccoli, rendendo difficile registrare da singole cellule; poiché il ratto è un modello animale comune per lo studio della degenerazione retinica, questo tipo di registrazioni ha il potenziale di produrre molte informazioni utili. La chiave per ottenere tali registrazioni è stata rappresentata dagli elettrodi in vetro tiriati che abbiamo progettato, dotati di una punta lunga e affilata, che permettono di registrare potenziali d'azione da assoni di piccolo diametro con un elevato rapporto segnale-rumore.Vi illustreremo il processo di fabbricazione di questi elettrodi e vi mostreremo come posizionare l'animale sull'apparato stereotassico; in seguito, vi mostreremo un esempio di registrazione di sequenze di impulsi da una singola cellula gangliare. Per la fabbricazione degli elettrodi sono necessari tre principali strumenti: un estrusore di vetro standard per produrre le micropipette, una ma

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Neuroscienze

Descriviamo un metodo relativamente semplice di transretinal elettroretinogramma (ERG) per l'ottenimento di registrazioni fotorisposte asta e cono da retina di topo intatto. Questo approccio sfrutta il blocco della trasmissione sinaptica da fotorecettori per isolare le loro risposte chiare e registrarli usando elettrodi posizionati sul campo in tutto il isolato piatto montato retina.

Transretinal Recordings ERG di retina di topo: Rod e fotorisposte Cone

Questo video dimostra la preparazione di un modello di ratto per studiare la salute della retina e l'integrità del percorso visivo. Il potenziale evocato visivo e il riferimento per l'elettroretinografia e gli elettrodi attivi sono collegati al ratto, seguiti dall'allineamento della piattaforma con il ratto davanti alla ciotola di Ganzfeld per un'illuminazione uniforme della retina e dalla chiusura della gabbia di Faraday per evitare interferenze esterne.

Preparazione di un modello di ratto per valutare l'integrità del percorso visivo utilizzando una configurazione di elettrofisiologia

Questo video mostra la procedura dettagliata per preparare un ratto anestetizzato per registrazioni elettrofisiologiche dell'attività cerebrale da più siti. Il cuoio capelluto viene sezionato per accedere al cranio e vengono praticati dei fori in punti precisi per installare e fissare gli elettrodi. Gli elettrodi a microfilo di tungsteno vengono quindi inseriti nella posizione mirata per registrare i dati.

Registrazioni elettrofisiologiche in vivo di attività cerebrali da più siti nei ratti

Questo video dimostra il processo di misurazione dei potenziali evocati visivi o VEP in un ratto anestetizzato adattato al buio con elettrodi cranici pre-impiantati, che registrano i segnali elettrici dalla corteccia visiva del cervello in risposta agli stimoli luminosi.

Registrazione dei potenziali evocati visivi tramite gli elettrodi del cranio in un modello di ratto

Questo video dimostra come registrare l'elettroretinogramma (ERG) e il potenziale evocato visivo (VEP) in un ratto cosciente. Il ratto, con elettrodi impiantati chirurgicamente, viene prima adattato al buio. Dopo aver applicato le gocce dilatanti, l'animale viene posto in un sistema di ritenuta e posizionato in una ciotola di Ganzfeld. I segnali ERG e VEP vengono quindi registrati.

Registrazione dell'elettroretinogramma e del potenziale evocato visivo in un ratto

Ex vivo ERG può essere utilizzato per registrare l'attività elettrica delle cellule retiniche direttamente da retine intatte isolate di animali o esseri umani. Dimostriamo qui come i comuni sistemi ERG in vivo possano essere adattati per registrazioni ERG ex vivo al fine di sezionare l'attività elettrica delle cellule retiniche.

Simultaneo<em&gt; Ex vivo</em&gt; Test funzionale di due retine per<em&gt; In vivo</em&gt; Sistema Elettroretinogramma

La demielinizzazione focale viene indotta nel nervo ottico utilizzando la microiniezione di lisolecitina. I potenziali evocati visivi vengono registrati tramite elettrodi del cranio impiantati sulla corteccia visiva per esaminare la conduzione del segnale lungo la via visiva in vivo. Questo protocollo descrive in dettaglio le procedure chirurgiche alla base dell'impianto di elettrodi e della microiniezione del nervo ottico.

Registrazione potenziale evocato visivo in un modello murino di sperimentale del nervo ottico demielinizzazione

Questo protocollo descrive la misurazione simultanea dell'elettroretinogramma e dei potenziali evocati visivi in ratti anestetizzati.

Registrazione simultanea di elettroretinografia e Potenziali evocati visivi nei ratti anestetizzati

Mostriamo le procedure di impianto e di registrazione chirurgiche per misurare i segnali elettrofisiologici visivi dall'occhio (elettroretinogramma) e il cervello (visivo potenziale evocato) nei ratti coscienti, che è più simile alla condizione umana in cui le registrazioni sono effettuate senza anestesia confonde.

L&#39;impianto e la registrazione di Wireless Elettroretinogramma e potenziale visivo evocato ratto conscio

Questo protocollo descrive un metodo per ottenere registrazioni in vivo di singoli neuroni ad alta densità dal tronco encefalico di topi fissati alla testa. Questo approccio viene utilizzato per misurare l'attivazione del potenziale d'azione dei neuroni nel grigio periacqueduttale ventrolaterale - una regione del tronco encefalico inattiva durante il sonno REM (Rapid Eye Movement) - prima e durante l'anestesia generale.

Registrazioni acute multi-elettrodo a unità singola dal tronco encefalico di topi fissati alla testa

Questo protocollo descrive una tecnica unica che utilizza un approccio transcongiuntivale per accedere al nervo ottico del ratto per le iniezioni.

Approccio transcongiuntivale per l'iniezione nel nervo ottico del ratto

Impara a registrare potenziali d'azione da singole cellule gangliari retiniche in vivo nel ratto anestetizzato utilizzando elettrodi in vetro al tungsteno. Questa tecnica innovativa consente registrazioni ad alto rapporto segnale-rumore.

Singola unità In vivo Registrazioni dal chiasma ottico di Rat

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