Name: シングルユニット in vivoで録音 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-02T15:15:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: 学ぶラット視交叉からのシングルユニットin vivo記録法。タングステン染色ガラス電極を用いて網膜神経節細胞からの活動電位を高S/N比で記録する技術を解説。網膜変性研究に有用な手法です。

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我々は、これらの実験技術の開発中に技術的なインプットを提供するための博士ダングリーンに感謝。この作品は、NIHグラントR01 - EY016849Aとスミスファミリー新奨励賞によってサポートされていました。

パートI：タングステンインガラス電極の作製<ol><li>グラファイトリングは、硝酸ナトリウム（0.71g/mL）と水1に溶解した水酸化カリウム（0.34g/mL）の濃縮液で満たされたビーカーに入れられ、ビーカーが変更されたミシンの縫製腕の下に置かれている。 </li><li>それは部分的に浸漬されるようにタングステン線（0.5ミリメートルの直径、6センチメートル長さ）は溶液中で（1〜2センチメートル）ミシンアームにテープで固定されています。 </li><li> 2Vは、グラファイトリングに縫製アームと負のリード線にプラス側のリード線を取り付けることによりタングステンワイヤを介して適用されます。 </li><li>ミシンがオンになっているとタングステンワイヤが電解鋭いポイントに金属をエッチングする2分、のための〜4Hzの速度で溶液中に繰り返し浸漬する。 </li><li>エッチングされたワイヤは、マニュアルマニピュレータ及びガラスピペット（0.25ミリメートルOD、0.175ミリメートルID）ガラスの引き手と1mmの先端に引っ張らのシャフトを持つ微細な指導（40倍の倍率）の下に整列点に配置されます。電線挿入中に動かないようにするため、ガラスは、一時的にパテを顕微鏡ステージに固定されている。 </li><li>ワイヤはシャフトの下、ガラスのunpulled最後に慎重に進んでおり、1μmの開口部を通してガラスの小片は、ガラス中のタングステンのタイトなフィットを示し、ビデオの先端を絶つために見られている。ワイヤーは、ラット光ファイバー録音用先端を越えて5〜10ミリメートルの周りに拡張する必要があります。 </li><li>シアノアクリレートは、ガラスのunpulled最後に適用され、硬化後の電気インピーダンスを測定して、1MΩの電極は、一般的に最も効果的場所。 </li></ol>パートII：定位セットアップとスパイクトレインレコーディング<ol><li>刺激の表示システムは、脳に電極を配置し、低下させるための定位固定装置とマイクロドライブと一緒に、ビデオに示されている。 </li><li>網膜スパイク列の記録を実行するためにラットを麻酔し、後に麻痺です。標準的な手順は、（図示せず）薬物送達および麻痺の間に機械的な換気のために気管（Y -チューブ）カニューレのための大腿静脈にカニューレの外科的挿入のために使用されています。実験は、動物用の端子です。 </li><li>準備手続の後、動物は加熱毛布の上に配置され、頭部は耳と歯のバーで、としてラット脳アトラス2で定義されて、定位位置に固定されています。 </li><li>直腸プローブは37℃体温を維持する恒温制御ユニット℃に介して加熱毛布を制御する、挿入される</li><li>金属針は、心電図やモニターの心拍数を測定するためにリード線として使用されます。 </li><li>皮膚は、頭蓋骨の上に開かれ、頭蓋骨のプレートの交点（ブレグマ）が公開されています。カスタム設計されたクロスバーのフレームを所定の位置に設定されている、円はクロスバーの穴に通しbegma周り頭蓋骨に記されています、とクロスバーは、一時的に削除されます。 </li><li>定位システムはブレグマ上のガイドの針を配置することによって較正されています。 5 mmの穴が著しい場所で頭蓋骨にドリルされ、骨が削除され、脳を露出させる。パテの細いリングが所定の位置にリセットされたクロスバー、の穴周りのシールを形成するために頭蓋骨の開口部の周りに置かれます。 </li><li>動物は、しばらく麻酔の安定した平面になっている場合、それはデータ収集時に目の動きを防ぐために、麻痺を注射されています。呼吸が停止した後、動物は機械的に換気される。カスタムプログラムでは、実験を通して換気と生理学的パラメータを追跡し、任意のパラメータが正常なレベルの外に行く必要の補償作用が必要な場合は実験者に知らせます。 </li><li>ガイド針はタングステン電極とbackloadedと脳に低下する。脳の浸透後にクロスバーの穴は、寒天（図示せず）が充填されている、とマイクロドライブのアセンブリは、機械的安定性のためのクロスバーにクランプされます。先端が視交叉が配置されている頭蓋骨、下は約8〜9ミリメートルになるまで、タングステン電極は、ガイド針アウト（2μm/sec）その後徐々に高度です。 </li><li>網膜神経節細胞に属するスパイクは、視覚入力への応答によって識別されます。単一の光ファイバの分離時に記録された細胞の受容野は、視覚的な空間にマッピングされ、その応答特性は、漂流格子や関心のある他の視覚的なパターンで特徴付けられる。システムの安定性は、数時間の3つのユニットの録音が可能になります。 </li></ol>材料成人ブラウンノルウェーラット（250〜400グラム）が商用ベンダーから購入し、規制（12/12）明/暗サイクル下で飼育した。麻酔は塩酸ケタミンとキシラジン（70、2 mg / kgを、それぞれ、ヘンリーシャイン社）の腹腔内注射で誘導とexperの期間中維持されたカテーテルを通して静脈内ブドウ糖、生理食塩水と混合ケタミンとキシラジンの投与（30及び1 mg / kg / hrの）、およびガラミンのtriethiodide（40 mg / kg体重/時、フィッシャー社）（0.13ミリメートルOD、スモールパーツ社とiment右大腿静脈で）。ガラミンは、目の動きを麻痺させる混合物に含まれています。心拍数と血圧の変動性によって評価される麻酔の安定した平面を維持するために必要なポンプ（WPI社）の注入速度を調節した。麻痺した後、動物は機械的にインラインで測定した呼気終末CO 2を維持するために、必要に応じて調整率で、60から80呼吸/分（2ccの体積）で気管カニューレを介して（ハーバード装置、モデル683）換気された30％でカプノメーター（ノバメトリックス社、モデル710Sp）。体温は恒温毛布の制御システム（ハーバード装置株式会社）を介して調節した。体温、呼吸終期のCO 2、心拍数、血圧を連続的にLabVIEWのプログラムで実験を通してモニターした。視覚刺激は、800x600ピクセルの解像度で100Hzで動作してソニーのマルチスキャン17E CRTモニター（30 cd / m 2の輝度を意味する）に発表されました。データ収集とモニター出力は、ビデオイメージプロセッサ（ケンブリッジリサーチシステム株式会社、ビット+ +）と心理物理学ツールボックス4との組み合わせでMATLABやLabVIEWで記述されたカスタムソフトウェアで制御されていました。動物は、コンタクトレンズ（眼インスツルメンツ社）を通じて、16.5センチメートルの距離で刺激ディスプレイ（40.4 X 30.2センチメートル）表示、および点眼液は眼の潤いを保つために、実験中に定期的に適用されました。刺激へのアクセス可能な視野は、フローティングテーブルの表面（TMC社）上記の定位固定装置（CoをStoelting）上昇14センチメートルで動物をマウントし、一緒にテーブルの上に移動し、カスタム設計のそりの上にモニターを設定し、逆により最大化されていた鼻は約± 100 °の円弧。これは60度を超えると35度目の高さ以下と± 42度横方向にモニタの中心からの延長repositionable表示フィールドを提供する。タングステンelectodesは、ガラスチップを形成するために使用された小型部品株式会社とフリードリヒとディモック社標準micropippeteプーラー（サッタインスツルメンツ、モデルP - 97）から得られたカスタムホウケイ酸ガラスから得られる線で作製した。電極インピーダンスのテスターは、朴エレクトロニクスから購入した。電極は、電動マイクロドライブシステム（ニューポート社、StepperMike）で進めていた。心電図および視神経の信号は、高入力インピーダンスの多電極アンプ（FHC社、X -セル× 4）で増幅し、ろ過した。ハートビートは、ウィンドウのディスクリミネータ（WPI社、モデル121）で検出した。神経の活動電位は、デジタルスパイク弁別（FHC社、APM）で0.1msの分解能で検出し、タイムスタンプが付けられた。スパイクディスクリミネータは、スパイク時間が刺激にロックされていたようにビデオ画像プロセッサからのトリガ信号によってゲートだった。

<ol><li>Levick, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Another+tungsten+microelectrode%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Biol+Eng%22%5BJournal%5D)">Another tungsten microelectrode.</a> Med Biol Eng. 10 (4), 510-515 (1972).</li>
<li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+rat+brain+in+stereotaxic+coordinates%22">The rat brain in stereotaxic coordinates</a>. , Fourth Edition, Academic Press. London, UK. (1998).</li>
<li>Freeman, D. K., Heine, W. F., Passaglia, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+maintained+discharge+of+rat+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Vis+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The maintained discharge of rat retinal ganglion cells.</a> Vis Neurosci. 25 (4), 535-548 (2008).</li>
<li>Brainard, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+psychophysics+toolbox%5BTitle%5D)+AND+%22Spat+Vis%22%5BJournal%5D)">The psychophysics toolbox.</a> Spat Vis. 10, 433-436 (1997).</li>
</ol>

すべての実験手順は、ボストン大学の動物実験使用の委員会によって承認された。

光ファイバーの録音は、そのまま目を必要とする網膜情報の符号化と伝送に関する実験的な質問に対処するための魅力的なアプローチです。電極が交差し、非クロス視神経線維の活動が単一の電極への浸透で記録することができます視交叉や消化管に配置されている場合、また、両眼のシグナル伝達特性は、ほぼ同じ生理的な状態で検討することができます。光ファイバーの録音は、げっ歯類のようなビジョンの研究で使用されている他の人気の動物モデルでそれらの小さいサイズに多分により猫に共通のものですが、。我々は、ラットにおける単繊維の活動を拾いに成功した、どれも同じようなインピーダンスと材料の商業電極、様々な試みている、私たちの電極のようないくつかの時間ができるためにそれを記録するどころか。これは、典型的な商用のものの広い丸い先端とは対照的に長く、鋭い先端を持っている私たちの電極、、の特定の幾何学は神経節細胞軸索スパイクの信頼性と安定した単離のために重要であることを意味します。これらの電極を作製する方法を示すに加えて、我々は、 生体の視覚神経生理学的研究のために私たちのカスタム設計の定位システムを示しています。システムは、環境振動から、電磁ノ...

シングルユニット in vivoで</emラットの視交叉から>録音

Single-unit In vivo Recordings from the Optic Chiasm of Rat

視覚的な世界に関する情報は、視神経を構成する網膜神経節細胞の軸索における活動電位のシーケンスで脳に伝達される。<em&gt; in vivoで</emいくつかの動物モデルにおける神経節細胞のスパイク列の&gt;録音はどのように初期視覚システムのプロセスについて知られていることの多くを明らかにし、視覚的情報をエンコードしている。しかし、そのような録音は、最も一般的な動物モデルの一つ、ラットで小径軸索によってトリガされるスパイクを検出することが困難である可能性によりまれてきた。ラットを含む多くの網膜疾患のモデルは、眼を持つかのように、目を乱すことなく、神経節細胞の機能的性質を特徴づけるための必要性を動機<em&gt; in vitroで</em&gt;レコーディング。ここで、我々は麻酔ラットの視交叉から神経節細胞スパイク列を記録するための方法を示しています。まず、ラットにおける単神経節細胞の軸索からの電気的活動を拾うことができるタングステンインガラス電極を作製する方法を示します。電極は、我々がしようとしたこと商業目的のものを上回っています。私たちは、その後のために私たちのカスタム設計の定位システムを示しています<em&gt; in vivoで</em&gt;視覚神経生理学の実験や動物の準備と視交叉における信頼性と安定した電極配置のための私たちの手続き。

網膜神経節細胞は、眼からの活動電位の配列との脳に視覚情報を送信する。ここで、我々は、単一の神経節細胞の活動電位を記録する方法を示しています<em&gt; in vivoで</em&gt;麻酔ラットから。

視覚世界に関する情報は、視神経を構成する網膜神経節細胞の軸索における一連の活動電位として脳へと伝達されます。

本日は、ラットの視交叉からin vivoで記録するために我々が開発した記録システムについて実演します。ラットにおけるこの種の記録は非常に稀でしたが、その理由の一つとして、視神経を構成する網膜神経節細胞の軸索が非常に小さいため、個々の細胞からの記録が困難であることが挙げられます。また、ラットは網膜変性の一般的な動物モデルであるため、このような記録は多くの有用な情報を得られる可能性があります。これらの記録を実現するための鍵となったのは、我々が設計したタングステイン染色ガラス電極です。この電極は先端が長く鋭いため、細い直径の軸索から高い信号対雑音比で活動電位を記録することが可能です。これらの電極の作製プロセスを詳しく説明し、動物を定位固定装置にセットする方法、そして単一の神経節細胞からスパイクトレインを記録する例を示します。電極の作製には、主に3つの装置が必要です。マイクロピペットを作成するための標準的なガラス管溶融機、タングステンの先端を研磨するためのミシン、および40倍の対物レンズを備えた標準的な顕微鏡です。さらに、電極を取り付けたグラファイトリングを用意し、水酸化カリウムと硝酸ナトリウムの濃縮溶液の中に配置します。これをミシンアームの下に設置し、次に細いタングステン線をミシンアームにテープで固定し、溶液に部分的に浸らせます。その後、リード線を一方の端のグラファイト電極からミシンアームへと接続します。その後、リード線に2 Vを印加し、ミシンを起動します。これによりタングステンが溶液に浸され、2分間電磁的に研磨されます。タングステンの研磨が完了したら、ミシンアームから慎重に取り出し、水に浸して過剰な溶液を除去した後、顕微鏡の40x対物レンズ下に配置します。ガラスマイクロピペットの開口部は、直径約1～2 µmと非常に小さくなっています。次に、鋭利にしたタングステンをマイクロピペットの後端に慎重に挿入し、メカニカルマイクロマニピュレーターを用いて押し込みます。タングステンをガラスの先端から非常に慎重に押し出してください。タングステンとガラスの間を密着させることが重要であり、通常は、少量のガラスが実際に欠ける程度に押し込みます。マイクロピペットの後端に少量の瞬間接着剤を塗布し、タングステンをガラスに固定します。電極の作製が完了したら、金属電極を用いてインピーダンス測定を行い、そのインピーダンス値を測定します。一般的に、1 MΩ付近のインピーダンスを確認します。電極は非常に脆弱であるため、その後、安全に保管するためにケースに収納します。視覚刺激は、可動式プラットフォーム上に設置されたモニターに提示されます。動物の体温を制御するために加熱ブランケットが使用され、ステレオタキシス装置によって、ここに示されているマイクロドライブの大まかな移動が行われます。皮下ガイド針シールド

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

我々は、無傷のマウス網膜から桿体と錐体の光応答を取得するためのtransretinal電図（ERG）の録音の比較的簡単な方法について説明します。このアプローチは、それらの光反応を分離し、分離されたフラットマウントされている網膜の間に配置フィールド電極を使用してそれらを記録する光受容体からシナプス伝達のブロックを活用しています。...

マウス網膜からERG Transretinal·レコーディング：ロッドとコーンの光応答

このビデオは、網膜の健康と視覚経路の完全性を研究するためのラットモデルの準備を示しています。視覚誘発電位と網膜電図の参照および能動電極をラットに接続し、続いてプラットフォームをガンツフェルドボウルの前でラットに位置合わせして網膜照明を均一にし、ファラデーケージを閉じて外部干渉を回避します。...

電気生理学セットアップを使用して視覚経路の完全性を評価するためのラットモデルの準備

このビデオは、麻酔をかけたラットを複数の部位からの脳活動の電気生理学的記録のために準備するための詳細な手順を示しています。頭皮を解剖して頭蓋骨にアクセスし、電極を取り付けて固定するために正確な位置に穴を開けます。次に、タングステンマイクロワイヤ電極を目標位置に挿入してデータを記録します。...

ラットの複数の部位からの脳活動のin vivo電気生理学的記録

このビデオは、光刺激に反応して脳の視覚野からの電気信号を記録する頭蓋骨電極を事前に埋め込んだ、暗順適応麻酔ラットの視覚誘発電位またはVEPを測定するプロセスを示しています。...

ラットモデルにおける頭蓋骨電極による視覚誘発電位の記録

このビデオでは、意識のあるラットで網膜電図(ERG)と視覚誘発電位(VEP)を記録する方法を示します。外科的に電極を埋め込んだラットは、最初に暗順応します。拡張液滴を適用した後、動物を拘束具に入れ、ガンツフェルドボウルに配置します。その後、ERG信号とVEP信号が記録されます。...

ラットにおける網膜電図と視覚誘発電位の記録

生体内ERGは、動物や人間の孤立した無傷の網膜から直接、網膜細胞の電気的活動を記録するために使用することができます。ここでは、網膜細胞の電気的活動を解剖するために、一般的なin vivo ERGシステムをex vivo...

同時<em&gt; ex vivoで</emによる二つの網膜の&gt;機能テスト<em&gt; in vivoで</em&gt;電図システム

限局性脱髄は、リゾレシチンマイクロインジェクションを使用して視神経に誘導されます。視覚誘発電位は、視覚野上に埋め込まれた頭蓋骨電極を介して記録され、in vivo...

実験視神経の脱髄のラットモデルにおける視覚誘発電位の記録

このプロトコルは、麻酔をかけたラットにおける網膜電図と視覚誘発電位の同時測定を説明しています。...

麻酔ラットにおける電図および視覚誘発電位の同時記録

私たちは、記録が麻酔の交絡せずに行われている人間の状態により類似している眼（網膜電位）と覚醒ラットにおける脳（視覚誘発電位）、からの視覚的な電気生理学的信号を測定するための外科的移植や録音手順を示しています。...

覚醒ラットに移植し、無線電図の記録と視覚誘発電位

ここでは、マウスにおける睡眠/覚醒状態のモニタリング中に特定のタイプのニューロンを光遺伝学的に操作する方法を説明し、ストリア末端のベッド核に関する最近の研究を例に挙げる。...

マウスにおける睡眠/覚醒状態のモニタリング中の神経回路の光遺伝学的操作

このプロトコルは、頭部固定マウスの脳幹から in vivoで高密度の単一ニューロン記録を取得する方法を説明する。このアプローチは、全身麻酔前および全身麻酔中に、腹外側水道周囲灰色 (急速眼球運動 (REM) 睡眠中に不活性な脳幹領域)...

頭部固定マウスの脳幹からの急性単一ユニット多電極記録

学ぶラット視交叉からのシングルユニットin vivo記録法。タングステン染色ガラス電極を用いて網膜神経節細胞からの活動電位を高S/N比で記録する技術を解説。網膜変性研究に有用な手法です。

シングルユニット in vivoで録音

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