Name: Extracción de ADN de los microbios del intestino de las termitas (Zootermopsis Angusticollis) y visualizar microbios intestinales (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-05-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 27 s
Description: Aprende a extraer ADN de microbios intestinales de termitas Zootermopsis angusticollis y visualizar su comunidad microbiana. Este método revela la diversidad y complejidad de las interacciones en el intestino posterior.

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Resumen del procedimiento para la extracción de ADN de las termitas de todo el intestino: <ol><li> Las termitas se enfría en hielo, retire del intestino utilizando pinzas estériles y estabilizar muestras de intestino en el buffer. </li><li> Homogeneizar las muestras de PVPP / SDS / buffer de fenol. </li><li> Extraer y purificar el ADN de lisado crudo utilizando columnas Qiagen DNeasy. </li></ol> Protocolo: <ol><li> En el hielo, remover las entrañas de las termitas casta de obreras con una pinza estéril. </li><li> Inmediatamente la transferencia de las agallas y el contenido de una solución estéril, libre de nucleasa tubo que contiene 50 L helada 1x biología molecular grado buffer TE (1 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0). Congelar las muestras a -20 ° C, o proceder directamente a una homogeneización. </li><li> Transferencia de las muestras de intestino y de amortiguación de una solución estéril, libre de nucleasa 2 ml tubo de tornillo tope pre-cargado con 500 mg de estériles de zirconia / sílica perlas (0,1 mm) y 700 l de 1x tampón TE que contenía 1% w / v polivinilpolipirrolidona (PVPP ). </li><li> Añadir 50 l de sulfato de sodio al 20% dodecilsulfato (SDS) y 500 l de fenol para las muestras. </li><li> Homogeneizar (golpe del talón) sobre el valor más alto con tres ciclos de 30 segundos homogeneización y 30 segundos de enfriamiento en hielo. </li><li> Sedimentos material insoluble durante 1 minuto a 8000 x g. </li><li> Purificar 300 l alícuotas de la fase acuosa (superior) de la capa de columnas Qiagen DNeasy utilizando el método descrito para la purificación del lisado crudo. </li><li> Cuantificar el contenido de ácido nucleico y las muestras se congelan a -20 ° C para su uso posterior. </li></ol>

<ol><li>Berthelet, M., Whyte, L. G., Greer, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+Direct+Extraction+of+DNA+from+Soils+for+PCR+Analysis+using+Polyvinylpolypyrrolidone+Spin+Columns%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Rapid, Direct Extraction of DNA from Soils for PCR Analysis using Polyvinylpolypyrrolidone Spin Columns.</a> FEMS Microbiol. Lett. 138, 17-22 (1996).</li>
<li>Kudo, T., Ohkuma, M., Moriya, S., Noda, S., Ohtoko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Phylogenetic+Identification+of+the+Intestinal+Anaerobic+Microbial+Community+in+the+Hindgut+of+the+Termite%2C+Reticulitermes+Speratus%2C+without+Cultivation%5BTitle%5D)+AND+%22Extremophiles%22%5BJournal%5D)">Molecular Phylogenetic Identification of the Intestinal Anaerobic Microbial Community in the Hindgut of the Termite, Reticulitermes Speratus, without Cultivation.</a> Extremophiles. 2, 155-161 (1998).</li>
<li>Moré, M. I., Herrick, J. B., Silva, M. C., Ghiorse, W. C., Madsen, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Cell+Lysis+of+Indigenous+Microorganisms+and+Rapid+Extraction+of+Microbial+DNA+from+Sediment%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Quantitative Cell Lysis of Indigenous Microorganisms and Rapid Extraction of Microbial DNA from Sediment.</a> Appl. Environ. Microbiol. 60, 1572-1580 (1994).</li>
<li>Odelson, D. A., Breznak, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volatile+Fatty+Acid+Production+by+the+Hindgut+Microbiota+of+Xylophagous+Termites%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Volatile Fatty Acid Production by the Hindgut Microbiota of Xylophagous Termites.</a> Appl. Environ. Microbiol. 45, 1602-1613 (1983).</li>
<li>Ottesen, E. A., Hong, J. W., Quake, S. R., Leadbetter, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+Digital+PCR+Enables+Multigene+Analysis+of+individual+Environmental+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Microfluidic Digital PCR Enables Multigene Analysis of individual Environmental Bacteria.</a> Science. 314, 1464-1467 (2006).</li>
<li>Purdy, K. J., Embley, T. M., Takii, S., Newdell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Extraction+of+DNA+and+rRNA+from+Sediments+by+a+Novel+Hydroxyapatite+Spin-Column+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid Extraction of DNA and rRNA from Sediments by a Novel Hydroxyapatite Spin-Column Method.</a> Appl. Environ. Microbiol. 62, 3905-3907 (1996).</li>
<li>Salmassi, T. M., Leadbetter, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Genes+of+Tetrahydrofolate-Dependent+Metabolism+from+Cultivated+Spirochaetes+and+the+Gut+Community+of+the+Termite+Zootermopsis+Angusticollis%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Analysis of Genes of Tetrahydrofolate-Dependent Metabolism from Cultivated Spirochaetes and the Gut Community of the Termite Zootermopsis Angusticollis.</a> Microbiology. 149, 2529-2537 (2003).</li>
<li>Schmitt-Wagner, D., Friedrich, M. W., Wagner, B., Brune, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic+Diversity%2C+Abundance%2C+and+Axial+Distribution+of+Bacteria+in+the+Intestinal+Tract+of+Two+Soil-Feeding+Termites+%28Cubitermes+spp%29%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic Diversity, Abundance, and Axial Distribution of Bacteria in the Intestinal Tract of Two Soil-Feeding Termites (Cubitermes spp).</a> Appl. Environ. Microbiol. 69, 6007-6017 (2003).</li>
<li>Tsai, Y. L., Olson, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Method+for+Separation+of+Bacterial+DNA+from+Humic+Substances+in+Sediments+for+Polymerase+Chain+Reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid Method for Separation of Bacterial DNA from Humic Substances in Sediments for Polymerase Chain Reaction.</a> Appl. Environ. Microbiol. 58, 2292-2295 (1992).</li>
</ol>

En nuestra experiencia, el ADN extraído de las comunidades microbianas de la alimentación de especies de termitas de madera como nevadensis Zootermopis es lo suficientemente puro para la plantilla de PCR después de una ronda de extracción y purificación. Sin embargo, algunas termitas tales como basura de alimentación y especies que se alimentan del suelo pueden tener una mayor concentración de ácidos húmicos en el contenido intestinal y puede requerir una purificación adicional de ADN microbiano intestinal. El rendimiento total de ADN de la...

<table><tbody><tr><td>PVPP/SDS/fenol</td><td>Tampón</td><td></td><td></td><td>tampón de homogeneización</td></tr><tr><td>Kit DNeasy Tissue</td><td>Kit</td><td>Qiagen</td><td>77607</td><td>Utilizado según el protocolo para el aislamiento de ADN genómico a partir de lisados crudos (Apéndice H, versión del manual del producto: julio de 2003)</td></tr><tr><td>TE</td><td>Tampón</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9285</td><td>tampón 1x (1 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0) a partir de concentrado 100x</td></tr><tr><td>esferas de circonia/sílice</td><td>Suministros</td><td>Biospec Products</td><td>11079101z</td><td>0,1 mm</td></tr><tr><td>PVPP</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6755</td><td>polivinilpolipirrolidona al 1 % p/v preparada a partir del reactivo seco como suspensión 1x en tampón TE</td></tr><tr><td>Zootermopsis nevadensis</td><td>Animal</td><td></td><td></td><td>Termitas</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4390</td><td>solución al 20 % de dodecilsulfato sódico en agua, a partir del reactivo seco</td></tr><tr><td>Fenol</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77607</td><td>saturado con TE, ~73 %</td></tr><tr><td>MiniBeadbeater-8</td><td>Herramienta</td><td>Biospec Products</td><td>963</td><td></td></tr><tr><td>BSS</td><td>Solución salina tamponada, pH 7,2</td><td></td><td></td><td>Fórmula por litro: 2,5 g K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 1,0 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 1,6 g KCl, 1,4 g NaCl, 0,075 g CaCl, 1 g MgCl y 10 mL de una solución 1 M de NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>AxioPlan-2</td><td>Microscopio</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td>Equipado con objetivo 40x, optivar 1,6x y lentes oculares 10x. Las muestras se observaron utilizando iluminación de contraste de fases</td></tr></tbody></table>

extracción de adn de los microbios del intestino de las termitas (zootermopsis angusticollis) y visualizar microbios intestinales

Extracting DNA from the Gut Microbes of the Termite (Zootermopsis Angusticollis) and Visualizing Gut Microbes

Las termitas se encuentran entre los pocos animales que sabe que tiene la capacidad de subsistir únicamente por el consumo de madera. El tracto intestinal termita contiene una población microbiana densa y rica en especies que contribuye a la degradación de la lignocelulosa predominantemente en acetato, el metabolismo de los nutrientes clave alimentando termitas (Odelson y Breznak, 1983). Dentro de estas poblaciones microbianas son bacterias, arqueas metanogénicas y, en algunos termitas (&quot;menor&quot;), eucariotas protozoos. Por lo tanto, las termitas son sujetos de investigación de excelencia para el estudio de las interacciones entre especies microbianas y las numerosas funciones bioquímicas que llevan a cabo en beneficio de su anfitrión. La composición de las especies de las poblaciones microbianas en el intestino de las termitas, así como los principales genes involucrados en diversos procesos bioquímicos se ha estudiado mediante técnicas moleculares (Kudo et al, 1998;. Schmit-Wagner et al, 2003;. Salmassi y Leadbetter, 2003). Estas técnicas dependen de la extracción y purificación de alta calidad, ácidos nucleicos del ambiente intestinal de termitas. La técnica de extracción se describe en este video es una compilación de modificación de los protocolos desarrollados para la extracción y purificación de ácidos nucleicos a partir de muestras ambientales (Mor et al, 1994;. Berthelet et al, 1996;. Purdy et al, 1996;. Salmassi y Leadbetter, 2003;. Ottesen et al 2006) y que produce material de ADN de las termitas del intestino grueso adecuado para su uso como plantilla para la reacción en cadena de polimerasa (PCR).

Este video muestra la técnica para extraer el ADN de las especies de microbios residentes en el intestino de termitas. La preparación de una diapositiva en fresco, que es útil para la visualización de la comunidad microbiana intestinal también se ilustra, y un recorrido por la riqueza de especies entorno intestinal es dado.

Extracción de ADN de los microbios del intestino de las termitas (Zootermopsis Angusticollis) y visualizar microbios intestinales

Las termitas se encuentran entre los pocos animales que se sabe que tienen la capacidad de subsistir consumiendo únicamente madera. El tracto intestinal de la termita contiene una densa y ...

Aquí, su reacción a este entorno no es, no es única. La mayoría de las personas, incluso los no científicos, se sorprenden bastante. Sí. Por la, la diversidad y la complejidad.Hola, mi nombre es Eric Matson y soy investigador posdoctoral en el Departamento de Ingeniería Ambiental y Científica en el Instituto de Tecnología de California. Mi trabajo bajo la dirección del profesor Jared Ledbetter se centra en las interacciones microbianas y la diversidad de especies que habitan en el intestino posterior de las termitas. En particular, estamos interesados en algunas de las vías bioquímicas que ocurren y especialmente en el proceso de acetogénesis, mediante el cual estos microorganismos consumen gases de hidrógeno y CO2 y los convierten en acetato, un nutriente clave en el metabolismo energético del hospedador termita.Yo y otros investigadores en el laboratorio hemos desarrollado conjuntos de cebadores específicos para poder analizar enzimas clave en esta vía. Sin embargo, para lograrlo, es necesario generar muestras de ADN limpias de la comunidad microbiana, ADN, que luego utilizaremos como dianas en este proceso. Por ello, hoy quiero demostrar cómo diseccionamos la especie de termita

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Research

Investigación

JoVE Journal

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Biología

Jared Leadbetter explica por qué la comunidad microbiana del intestino de termitas es un sistema excelente para estudiar las complejas interacciones entre los microbios. La relación simbiótica que existe entre el insecto huésped y lignocelulosa degradantes microbios intestinales se explica, así como los usos industriales de estos microorganismos para degradar la biomasa vegetal y los biocombustibles de generación.

La investigación de la comunidad microbiana en el intestino de termitas - Entrevista

Jared Leadbetter nos lleva por un paseo por la naturaleza a través de la diversidad de la vida reside en el intestino de termitas - un microambiente que contiene 250 especies diferentes que se encuentran en ningún otro lugar en la Tierra. Jared revela que la simbiosis exhibida por este sistema es multi-nivel y no sólo implica una relación entre las termitas y sus habitantes intestino, pero también implica una compleja red de la simbiosis entre los microbios intestinales sí mismos.

Capas de Simbiosis - Visualización del intestino posterior, las termitas de la comunidad microbiana

Se presentan los procedimientos para demostrar que los ligandos se unen a la membrana de la superficie de la celulosa para digerir estos protozoos en el intestino de las termitas subterráneas de Formosa utilizando microscopía de fluorescencia y los ligandos que, junto con los péptidos líticos matar...

Prueba de Actividad Protozoacidal de ligando-lítica péptidos intestinales contra termitas protozoos In vitro (Cultura protozoos) y In vivo (Microinyección en termitas intestino grueso)

La comunidad bacteriana activo asociado con el intestino de Spodoptera littoralis, se determinó por isótopos estables-palpador (SIP) acoplado a la pirosecuenciación. Utilizando esta metodología, se realizó la identificación de las especies de bacterias metabólicamente activas dentro de la comunidad con alta resolución y precisión.

La identificación de bacterias metabólicamente activas en el intestino de la Generalista<em&gt; Spodoptera littoralis</em&gt; Vía ADN isótopos estables Uso<sup&gt; 13</sup&gt; C-glucosa

Aquí, describimos un protocolo para obtener datos de la secuencia del amplicón del suelo, rizosfera y raíz endosphere microbiomes. Esta información puede utilizarse para investigar la composición y diversidad de las comunidades microbianas asociadas de planta y es conveniente para el uso con una amplia gama de especies de plantas.

Explorar el microbioma de la raíz: extracción de datos de la comunidad bacteriana del suelo, rizosfera y raíz Endosphere

Aquí, presentamos un protocolo evaluar espacial y temporal la presencia de microbiota viable en agallas de señal usando un acercamiento modificado todo montaje de hibridación in situ.

Visualización de la Microbiota en agallas de garrapata por Whole-mount In Situ hibridación

Este protocolo simplificado detalla un flujo de trabajo para detectar e obtener imágenes de bacterias en muestras de tejido complejo, desde la fijación del tejido hasta la tinción de microbios con hibridación fluorescente in situ .

Visualización de las interacciones entre la microbiota intestinal y el huésped a través de la hibridación fluorescente in situ , la tinción de lectina y la obtención de imágenes

Los nematodos de Caenorhabditis silvestre están asociados con muchos microbios, a menudo en la luz intestinal o infectando el intestino. Este protocolo detalla un método para enriquecer microbios inculturables que colonizan el intestino, aprovechando la resistencia de la cutícula dauer.

Limpieza selectiva de nematodos silvestres de Caenorhabditis para enriquecer las bacterias del microbioma intestinal

Para obtener un insecto axénico, se esteriliza la superficie de su huevo y la larva eclosionada se cría posteriormente con hojas axiénicas. Este método proporciona una forma eficiente para la preparación de insectos axénicos sin administrar antibióticos o desarrollar una dieta artificial, que también se puede aplicar a otros insectos que comen hojas.

Preparación y cría de insectos axénicos con plántulas cultivadas en tejidos para estudios de interacción entre la microbiota huésped-intestino del escarabajo de la hoja

Los microcosmos de compost llevan la diversidad microbiana que se encuentra en la naturaleza al laboratorio para facilitar la investigación del microbioma en Caenorhabditis elegans. Aquí se proporcionan protocolos para establecer experimentos de microcosmos, y los experimentos demuestran la capacidad de modular la diversidad microbiana ambiental para explorar las relaciones entre la diversidad microbiana ambiental y la composición del microbioma intestinal del gusano.

Microcosmos de compost como entornos microbianamente diversos y naturales para la investigación del microbioma en Caenorhabditis elegans

Proponemos un protocolo optimizado de Microscopía Electrónica de Barrido para la visualización de muestras altamente heterogéneas y delicadas que contienen biomasa vegetal y fúngica, junto con microbiota y biofilm. Este protocolo permite describir las dimensiones espaciales de la organización de la microbiota.

Microbiota de los hormigueros de Atine: visualización de un paisaje microbiano mediante microscopía electrónica de barrido

Aprende a extraer ADN de microbios intestinales de termitas Zootermopsis angusticollis y visualizar su comunidad microbiana. Este método revela la diversidad y complejidad de las interacciones en el intestino posterior.

Extracción de ADN de los microbios del intestino de las termitas (Zootermopsis Angusticollis) y visualizar microbios intestinales (Video) | JoVE Journal

Extracción de ADN de los microbios del intestino de las termitas (Zootermopsis Angusticollis) y visualizar microbios intestinales

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