Name: El examen de los telómeros G-Estructura en voladizo Trypanosoma brucei (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-26T17:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 25 s
Description: Aprende a examinar la estructura G-overhang de telómeros en Trypanosoma brucei mediante hibridación nativa en gel y extensión de cebador mediada por ligadura. Estos métodos permiten analizar la estabilidad cromosómica.

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Nos gustaría agradecer a la Dra. Carolyn Precio de los debates científicos y sugerencias perspicaces. Este trabajo es apoyado por el NIH subvención AI066095 (PI: Bibo Li).

<ol><li>Munoz-Jordan, J. L., Cross, G. A., de Lange, T., Griffith, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((t-loops+at+trypanosome+telomeres%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">t-loops at trypanosome telomeres.</a> EMBO J. 20, 579-588 (2001).</li>
<li>Li, B., Espinal, A., Cross, G. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypanosome+telomeres+are+protected+by+a+homologue+of+mammalian+TRF2%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Trypanosome telomeres are protected by a homologue of mammalian TRF2.</a> Mol Cell Biol. 25, 5011-5021 (2005).</li>
<li>Wellinger, R. J., Wolf, A. J., Zakian, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saccharomyces+telomeres+acquire+single-strand+TG1-3+tails+late+in+S+phase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Saccharomyces telomeres acquire single-strand TG1-3 tails late in S phase.</a> Cell. 72, 51-60 (1993).</li>
<li>McElligott, R., Wellinger, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+terminal+DNA+structure+of+mammalian+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The terminal DNA structure of mammalian chromosomes.</a> EMBO J. 16, 3705-3714 (1997).</li>
<li>Harrington, L. A., Greider, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomerase+primer+specificity+and+chromosome+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Telomerase primer specificity and chromosome healing.</a> Nature. 353, 451-454 (1991).</li>
<li>Jacob, N. K., Skopp, R., Price, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G-overhang+dynamics+at+Tetrahymena+telomeres%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">G-overhang dynamics at Tetrahymena telomeres.</a> Embo J. 20, 4299-4308 (2001).</li>
<li>Barry, J. D., McCulloch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigenic+variation+in+trypanosomes%3A+enhanced+phenotypic+variation+in+a+eukaryotic+parasite%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Antigenic variation in trypanosomes: enhanced phenotypic variation in a eukaryotic parasite.</a> Adv Parasitol. 49, 1-70 (2001).</li>
<li>Yang, X., Figueiredo, L. M., Espinal, A., Okubo, E., Li, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAP1+is+essential+for+silencing+telomeric+variant+surface+glycoprotein+genes+in+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RAP1 is essential for silencing telomeric variant surface glycoprotein genes in Trypanosoma brucei.</a> Cell. 137, 99-109 (2009).</li>
</ol>

Tripanosoma brucei causa la enfermedad del sueño en los seres humanos. Esta enfermedad, si no se trata, es inevitablemente fatal. T. células brucei en huéspedes mamíferos sufren variación antigénica con regularidad con el fin de evadir el ataque inmune del huésped 7. Por lo tanto, es muy difícil de eliminar T. brucei células una vez que la infección se ha establecido. Recientemente hemos demostrado que los telómeros desempeñan un papel importante en la regulación de la expr...

<table><tbody><tr><td>Agarosa SeaKem LE</td><td>Lonza Inc.</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa tipo VII (agarosa de fusión baja)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4018</td><td></td></tr><tr><td>Proteasa K recombinante, grado PCR</td><td>Roche Group</td><td>03 115801001</td><td></td></tr><tr><td>Exo I</td><td>New England Biolabs</td><td>M0293</td><td></td></tr><tr><td>Exo T</td><td>New England Biolabs</td><td>M0265</td><td></td></tr><tr><td>Exonucleasa T7</td><td>New England Biolabs</td><td>M0263</td><td></td></tr><tr><td>Polimerasa de ADN T4</td><td>New England Biolabs</td><td>M0203</td><td></td></tr><tr><td>Kit QIAquick de eliminación de nucleótidos</td><td>Qiagen</td><td>28304</td><td></td></tr></tbody></table>

el examen de los telómeros g-estructura en voladizo trypanosoma brucei

Examination of the Telomere G-overhang Structure in Trypanosoma brucei

Los telómeros G-voladizo estructura ha sido identificada en muchos eucariotas como levaduras, los vertebrados, y Trypanosoma brucei. Que sirve como sustrato para la telomerasa para la síntesis de novo del ADN de los telómeros y por lo tanto, es importante para el mantenimiento de los telómeros. T. brucei es un parásito protozoario que causa la enfermedad del sueño en los seres humanos y nagana en el ganado. De acogida, una vez infectados los mamíferos, T. celular brucei regularmente cambia su antígeno de superficie para evadir el ataque inmunológico del huésped. Recientemente hemos demostrado que el T. brucei estructura de los telómeros desempeñan un papel esencial en la regulación de la expresión del gen del antígeno de superficie, lo cual es fundamental para la T. brucei patogénesis. Sin embargo, T. brucei estructura de los telómeros no ha sido ampliamente estudiado debido a la limitación de los métodos para el análisis de esta estructura especializada. Ahora hemos adoptado con éxito los nativos en gel de la hibridación y la ligadura mediada por los métodos de extensión del cebador para el examen de los telómeros G-voladizo estructura y un método de ligadura de adaptador para la determinación de la terminal de los telómeros de nucleótidos en T. brucei células. Aquí, vamos a describir en detalle los protocolos y comparar sus ventajas y limitaciones.

Los telómeros son esenciales para la estabilidad de los cromosomas y los telómeros G-voladizo estructura es esencial para la telomerasa mediada mantenimiento de los telómeros. Recientemente hemos aprobado dos métodos para la detección de los telómeros G-estructura en voladizo<em&gt; Trypanosoma brucei</em&gt;, Que son nativos en gel de hibridación y la ligadura mediada por extensión del cebador, que se describe.

El examen de los telómeros G-Estructura en voladizo Trypanosoma brucei

La estructura del voladizo G telomérico se ha identificado en muchos eucariotas, incluidos los hongos levuriformes, los vertebrados y Trypanosoma brucei. Esta sirve como sustrato ...

El objetivo general del siguiente experimento es examinar la estructura del extremo 3' rico en G de los telómeros en células de *Trypanosoma brucei*. La hibridación nativa en gel utiliza una sonda oligonucleotídica específica de secuencia para hibridarse con la región de cadena sencilla del telómero bajo condiciones nativas.Esta región de cadena sencilla es la región del extremo 3' sobresaliente de G del telómero y, por lo tanto, la cantidad de sonda de oligo hibridada representa la longitud del adaptador. La ligación permite determinar la secuencia terminal del extremo sobresaliente de G del telómero cuando el oligo único está marcado. Este método implica la ligación de un adaptador específico de secuencia al extremo de la estructura del extremo sobresaliente de G del telómero para el ensayo de extensión primaria mediado por ligación.El oligo guía se marca en el extremo y es análogo al oligo único antes de ligarse a los extremos del cromosoma. Después de la ligación, se realiza una extensión primaria utilizando la ADN polimerasa T4. Luego, se puede determinar la longitud del extremo sobresaliente G, ya que el producto tiene seis nucleótidos menos que la longitud real del extremo s

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

La dinámica de los glicosomas en los tripanosomas africanos es difícil de estudiar mediante técnicas tradicionales de biología celular como la microscopía electrónica y de fluorescencia.  Como medio para observar el comportamiento dinámico de los orgánulos, se ha utilizado un sistema reportero de orgánulos fluorescentes junto con la citometría de flujo para monitorear la dinámica de los glucosomas en tiempo real en parásitos vivos.

El uso de proteínas fluorescentes de Seguimiento glicosoma Dinámica en el tripanosoma africano

Reportamos un procedimiento conciso de hibridación fluorescente in situ (FISH) en la gónada y embriones de Caenorhabditis elegans para observar y cuantificar secuencias repetitivas. Observamos y cuantificamos con éxito dos secuencias repetitivas diferentes, las repeticiones de telómeros y la plantilla de alargamiento alternativo de telómeros (TALT).

La observación y cuantificación de los telómeros y las secuencias repetitivas usando fluorescencia<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación (FISH) con sondas de PNA en<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

La adición de una etiqueta a una proteína es una forma poderosa de obtener información sobre su función. Aquí, describimos un protocolo para marcar endógenamente cientos de proteínas de Trypanosoma brucei en paralelo, de modo que se pueda lograr el marcaje a escala del genoma.

De Alto Rendimiento de genes de marcado en las<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Los tripanosomas africanos cultivados in vitro experimentan variación antigénica a una tasa baja, de modo que las poblaciones están formadas por parásitos que expresan un tipo de glicoproteína de superficie (VSG) variante dominante y una pequeña población de variantes "conmutadas".  Este protocolo describe un método rápido para detectar y cuantificar estas poblaciones.

Detección de<em&gt; Trypanosoma brucei</em&gt; Variant glicoproteína de superficie de conmutación por Magnetic Activated Cell Sorting y Citometría de Flujo

Este informe describe un protocolo de preparación de muestras y condiciones de imagen específicas para realizar tomografía electrónica de transmisión de barrido de muestras biológicas gruesas.

Preparación y observación de muestras biológicas mediante el escaneo de grueso Electrónica de Transmisión de Positrones

En este artículo, se discute un protocolo detallado para cuantificar la longitud de los telómeros usando un análisis de fragmentos de restricción terminal modificado que proporciona una medición directa rápida y eficiente de la longitud de los telómeros. Esta técnica puede aplicarse a una variedad de fuentes celulares de ADN para cuantificar la longitud de los telómeros.

Análisis de fragmentos de restricción de terminales modificados para cuantificar longitud de telómeros mediante hibridación en gel

El agente Trypanosoma cruzi enfermedad de Chagas produce infecciones asintomáticas de larga duración que convertirse abruptamente en patología clínicamente reconocida. El siguiente protocolo de investigación describe un estudio epidemiológico de corto plazo basado en la familia para desentrañar la infección de T. cruzi transmitida sexual de los padres a la progenie.

Transmisión sexual de tripanosomas americanos de machos y hembras a compañeros de ingenua

Este método de separación de tripanosoma de sangre depende de su carga superficial ser menos negativa que mamífero las células de la sangre. Sangre infectada es colocada y tratada en una columna de intercambiador de aniones. Este método, más apropiado diagnóstico de la tripanosomiasis africana, proporciona parásitos purificados para las investigaciones inmunológicas, biológicas, bioquímicas, farmacéutica y biología molecular.

Purificación de tripanosomas extracelulares, incluyendo a africano, de la sangre por intercambiadores de aniones (celulosa Diethylaminoethyl columnas)

La aspiración de aguja fina es una técnica, mediante la que las células se obtienen de una lesión u órgano utilizando una aguja delgada. El material aspirado se frota, se tiñe y se examina bajo un microscopio para su diagnóstico o se utiliza para biología molecular, citometría o análisis in vitro. Es barato, simple, rápido y causa un trauma mínimo.

Detección de parásitos de tripanosoma extravascular por aspiración de aguja fina

Este estudio muestra un protocolo detallado para realizar microscopía de expansión de ultraestructura en tres etapas del ciclo de vida in vitro de Trypanosoma cruzi, el patógeno responsable de la enfermedad de Chagas. Incluimos la técnica optimizada para las proteínas del citoesqueleto y el marcaje panproteoma.

Microscopía de expansión ultraestructural en tres etapas del ciclo de vida in vitro de Trypanosoma cruzi

Este protocolo demuestra el uso de pinzas magnéticas de una sola molécula para estudiar las interacciones entre las proteínas teloméricas de unión al ADN (Telomere Repeat-binding Factor 1 [TRF1] y TRF2) y los telómeros largos extraídos de células humanas. Describe los pasos preparatorios para los telómeros y los factores de unión de repetición telomérica, la ejecución de experimentos de una sola molécula y los métodos de recopilación y análisis de datos.

Análisis de las interacciones teloméricas proteína-ADN utilizando pinzas magnéticas de una sola molécula

Aprende a examinar la estructura G-overhang de telómeros en Trypanosoma brucei mediante hibridación nativa en gel y extensión de cebador mediada por ligadura. Estos métodos permiten analizar la estabilidad cromosómica.

El examen de los telómeros G-Estructura en voladizo Trypanosoma brucei

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