Island Assay: En high-throughput metode til at evaluere Drosophila Locomotor Behavior

- Øen assay består af en hævet hvid platform i en bakke med sæbevand, dækket af en gennemsigtig kasse med en åben side. Et kamera på toppen af boksen registrerer overhead billeder af platformen, og lys er placeret for at sikre selv belysning af området.

For at indlæse fluerne på arenaen skal du trykke på et hætteglas mod en flad overflade for at bringe alle fluerne til bunden. I hurtig rækkefølge skal du fjerne hætteglasset, dreje hætteglasset og trykke på hætteglassets åbne ende på platformen for at slå alle fluerne ud på samme tid. Landing på platformen udløser en flugtrespons. Fluer med typisk mobilitet kan rydde platformen på få sekunder, i modsætning til dem med locomotoriske defekter.

Forsøgspersonerne er begrænset til kassen, og dem, der lander på sæbevandet, nedsænkes hurtigt, fordi sæbe reducerer vandets overfladespænding. For at vurdere lokomotorisk adfærd fra forskellige forhold skal du tælle de resterende fluer på platformen efter en bestemt tidsperiode.

I dette eksempel protokol, vil vi se en opsætning af øen assay kompatibel med semi-automatiseret billedanalyse.

- For det første skal du forberede mindst tre hætteglas pr. eksperimentel tilstand som biologiske replikater. Hvert hætteglas skal indeholde ca. 15 fluer af samme køn og lignende alder.

Opret mapperne til lagring af eksperimenterne. Generer disse i en mappestruktur, der er defineret af betingelserne og replikeringerne. Hvis eksperimentet f.eks.

Dernæst skal du indstille testapparatet. Tilsæt koldt vand med en lille mængde sæbe til badebakken og placer platformen midt i badet, hvis den ikke allerede er fastgjort i badet.

For at belyse platformen skal du placere en kølig lampe, såsom almindelige 12-volts LED'er, over den. Placer også et webcam, der er tilsluttet en computer direkte over platformen.

På computeren skal du åbne billedoptagelsessoftwaren. Fra menusystemet skal du vælge det relevante webcam som indfangningsenheden. Placer en død flue på øen for at justere videoindstillingerne.

Derefter skal du justere den tid, der går filmopsætningen, for at gemme filmene som AVI-filer.

Til komprimering af billeddataene skal du vælge Intel IYUV-koden.

Til sidst skal du gå til indstillingen Avanceret og vælge Opret et BNP-billede for hver hentet ramme. Gå derefter til den samme mappe, som du har valgt at være vært for AVI-filerne, og tryk på OK.

Før du begynder, skal du sørge for, at øen er tom og ren. Start derefter optagelsen i den tid, der går billedgrænsefladen i billedoptagelsessoftwaren.

Tag et hætteglas indeholdende fluer og tryk på det to eller tre gange for at banke alle fluerne ned til bunden. Derefter skal du hurtigt fjerne stikket fra hætteglasset og kraftigt trykke på fluerne på platformen. De skal alle ramme platformen på omtrent samme tid.

Giv fluerne op til 30 sekunder til at forlade platformen. Stop derefter optagelsen. Hvis det er nødvendigt, skal du manuelt fjerne eventuelle resterende fluer fra platformen.

Før du går videre til det næste eksperiment, skal du være sikker på at omdefinere den mappe, hvor det næste sæt data skal gemmes.