Island Assay: En høy gjennomstrømningsmetode for å evaluere Drosophila Locomotor Behavior

- Øyanalysen består av en hevet hvit plattform i et brett med såpevann, dekket av en gjennomsiktig boks med en åpen side. Et kamera på toppen av esken registrerer overheadbilder av plattformen, og lys er plassert for å sikre jevn belysning av området.

For å laste fluene på arenaen, trykk på et hetteglass mot en flat overflate for å bringe alle fluene til bunnen. I rask rekkefølge, fjern hetteglasspluggen, snu hetteglasset og trykk hetteglassets åpne ende på plattformen for å slå alle fluene ut samtidig. Landing på plattformen utløser en rømningsrespons. Fluer med typisk mobilitet kan tømme plattformen om noen sekunder, i motsetning til de med lokomotorfeil.

Forsøkspersonene er begrenset til esken, og de som lander på såpevannet, senkes raskt fordi såpe reduserer vanns overflatespenning. For å vurdere lokomotorisk oppførsel fra forskjellige forhold, tell de resterende fluene på plattformen etter en angitt tidsperiode.

I denne eksempelprotokollen vil vi se et oppsett av øyanalysen som er kompatibel med halvautomatisk bildeanalyse.

- For det første, lag minst tre hetteglass per eksperimentell tilstand som biologiske replikerer. Hvert hetteglass skal inneholde ca. 15 fluer av samme kjønn og lignende alder.

Opprett mappene for å lagre eksperimentene. Generer disse i en katalogstruktur som er definert av betingelsene og replikerer. Hvis eksperimentet for eksempel har to genotyper med fem replikerer hver, oppretter du en hovedmappe med datoen for eksperimentet, og i den mappen oppretter du en undermappe for hver genotype. Deretter oppretter du undermapper for hver replikering i genotypemappene.

Deretter setter du opp testapparatet. Tilsett kaldt vann med en liten mengde såpe i badekarbrettet og plasser plattformen midt i badekaret, hvis ikke allerede er festet i badekaret. Dekk brettet og plattformen med en gjennomsiktig boks.

For å belyse plattformen, plasser en kul lampe, for eksempel vanlige 12-volts lysdioder, over den. Plasser også et webkamera koblet til en datamaskin rett over plattformen.

På datamaskinen åpner du bildeopptaksprogramvaren. Fra menysystemet velger du riktig webkamera som fangstenhet. Plasser en død flue på øya for å justere videoinnstillingene. Juster lysstyrken, kontrasten og fargen i programvaren slik at den døde fluen vises svart mot en hvit bakgrunn.

Deretter justerer du tidsforløpfilmoppsettet for å lagre filmene som AVI-filer. Bla deretter til katalogen der dataene skal lagres, og definer navnet på filmen.

For komprimering av bildedataene velger du Intel IYUV-koden. Sett opptakshastigheten til ett bilde hvert 0.1 sekund og juster den tilsvarende avspillingshastigheten til 10 bilder per sekund.

Til slutt går du til Avansert-innstillingen og velger Opprett et BNP-bilde for hver fangede ramme. Bla deretter til samme katalog som du har valgt å være vert for AVI-filene og trykk OK.

Før du begynner, må du sørge for at øya er tom og ren. Start deretter innspillingen i tidsforløpbildegrensesnittet til bildeopptaksprogramvaren.

Ta et hetteglass som inneholder fluer og trykk det to eller tre ganger for å slå alle fluene ned til bunnen. Deretter fjerner du raskt pluggen fra hetteglasset og trykker kraftig på fluene på plattformen. De skal alle treffe plattformen omtrent samtidig.

Gi fluene opptil 30 sekunder for å forlate plattformen. Stopp deretter opptaket. Om nødvendig, fjern eventuelle gjenværende fluer manuelt fra plattformen.

Før du går videre til neste eksperiment, må du være sikker på å omdefinere katalogen der neste sett med data skal lagres.