To-foton laserindusert nevral skade: En metode for å observere Axon degenerasjon og regenerering i Drosophila larver

- Begynn med å montere en ren, bedøvet larve under en glassdekselslipp med hodet opp. Deretter eksponerer du interesseområdet ved å skyve dekselet forsiktig for å rulle larven og justere posisjonen. Bruk konfokal avbildning for å finne larvens nevrale celler. Identifiser en bestemt axon på en av mål nevralcellene som skadested.

Utsett deretter målakselen for en to-foton laser med høyere effekt enn det som brukes til avbildning for å indusere skade. En to-foton laser brukes på grunn av sin evne til å trenge inn og nøyaktig lokalisere skade i levende vev med minimal skade på omkringliggende vev.

Stopp lasereksponeringen umiddelbart når det er skade på målnevronen, noe som resulterer i axotomi eller kutting av axonen. Til slutt, bilde den skadede nevronen for å se degenerasjonen og etterfølgende regenerering på ønsket tidspunkt.

I eksempelprotokollen vil vi montere en larve for mikroskopi, indusere skade på larval sensoriske nevroner og spore nevral regenerering.

- Begynn med bedøvelse av larvene. I en avtrekkshette legger du en 60 millimeter glassfat i en 15 centimeter plast petriskål. Brett deretter et stykke vevspapir og legg det i glassfatet. Legg drueagarplaten på vevet etter at diettens eter er tilsatt.

Deretter legger du en dråpe halokarbon 27 olje i midten på et glasssklie, og legger en flekk vakuumfett på hvert av de fire hjørnene. Bruk deretter tang til å overføre en larve til agarplaten og dekk glassfatet for å bedøve larven. Så snart lavaen slutter å bevege seg, må du forsiktig overføre den til halokarbonoljen med hodet oppreist.

Deretter bruker du mild kraft til å skyve dekselslippet for å rulle cellene som skal ablated til der to-foton laseren lettest vil treffe dem. Plasseringen vil variere avhengig av hvilke nevroner som blir målrettet. Nå sikre monteringen på to-foton mikroskop scenen og fokus på cellene av interesse ved hjelp av en 40x olje nedsenking mål.

I programvaren bytter du til skannemodus og laster inn den lagrede protokollen. Forsikre deg om at pinhole er åpnet hele veien. Deretter, i live-modus, få et godt bilde av interesseområdet.

Deretter stopper du live-skanningen slik at beskjæringsknappen blir tilgjengelig. Bruk beskjæringsfunksjonen, juster skannevinduet for å fokusere målområdet på bare det potensielle skadestedet. Åpne deretter et nytt bildevindu. Nå reduserer du skannehastigheten og øker laserintensiteten. Deretter bytter du den kontinuerlige knappen for å starte og stoppe skanningen. Se nøye. Så snart det er en drastisk økning i fluorescens, avslutt skanningen.

Deretter bytter du tilbake til det opprinnelige bildevinduet og velger live-modus, og finner regionen som nettopp ble målrettet ved å justere fokuset.

- En god indikasjon på vellykket skade er utseendet på et lite krater, ringlignende struktur eller lokalisert rusk rett på skadestedet. Hvis laserstrømmen var for høy, ville et stort skadet område være synlig, noe som kan være dødelig.

- Fjern nå dekselslippet forsiktig, og overfør den skadede larven til en ny tallerken med gjærpasta. Sett platen i en 60 millimeter tallerken sammen med et propionsyre-gjennomvåt vev.

For etterfølgende bildebehandling av larven, bruk det lagrede konfokale oppsettet og samle z stack-bilder med et 25x mål. Pass på å inkludere normaliseringspunktet slik at regenereringen kan kvantifiseres.