Двухфотонная лазерная индуцированная нейронная травма: метод наблюдения аксоновой дегенерации и регенерации в личинках дрозофилы

- Начните с монтажа чистой, анестезированной личинки под стеклянной крышкой скольжения с головой вверх. Далее, разоблачить область интереса, мягко толкая крышку скольжения ролл личинки и настроить свое положение. Использование конфокальных изображений, чтобы найти личинки нервных клеток. Определить конкретный аксон на одной из целевых нервных клеток в качестве места для травмы.

Затем подвергайте целевой аксон двухколоновому лазеру с более высокой мощностью, чем используется для визуализации, чтобы вызвать повреждение. Двухколонный лазер используется из-за его способности проникать и точно локализовать повреждения в живой ткани с минимальным ущербом окружающим тканям.

Остановить лазерное воздействие немедленно, когда есть повреждение целевого нейрона, в результате аксотомии, или разрыв аксона. Наконец, изображение раненого нейрона для просмотра его дегенерации и последующей регенерации в нужные точки времени.

В примере протокола мы смонтировать личинку для микроскопии, вызвать повреждение личиночковых сенсорных нейронов и отслеживать нейронную регенерацию.

- Начните с анестезии личинок. В паровой капюшон поместите 60-миллиметровую стеклянную тарелку в 15-сантиметровую пластиковую чашку Петри. Затем сложите лист бумаги и поместите его в стеклянную тарелку.

Далее, на стеклянную горку поместите одну каплю галоуглеродного масла 27 в центре и поместите пятно вакуумной смазки на каждый из четырех углов. Затем используйте типсы для переноса одной личинки на агарную пластину и накройте стеклянную тарелку, чтобы обезболить личинку.

Далее, используйте мягкую силу, чтобы сдвиньте крышку скольжения, чтобы свернуть клетки, чтобы быть ablated туда, где двухфотонный лазер будет наиболее легко поразить их. Местоположение будет варьироваться в зависимости от того, что нейроны в настоящее время мишенью. Теперь обеспечить сборку на стадии двухфотонного микроскопа и сосредоточиться на клетках, представляющих интерес с помощью 40x цели погружения нефти.

В программном обеспечении переключитесь на режим сканирования и загрузите сохраненный протокол. Убедитесь, что пинхол открыт дот. Затем, в режиме живого времени, получите хорошее изображение области интереса.

Далее, остановите живое сканирование так, чтобы кнопка урожая стала доступной. Использование функции урожая, отрегулируйте окно сканирования, чтобы сосредоточить целевую область только на перспективном месте травмы. Затем откройте новое окно изображения. Теперь уменьшите скорость сканирования и увеличьте интенсивность лазера. Затем переключите непрерывную кнопку, чтобы начать и остановить сканирование. Смотрите внимательно.

Затем переключитесь обратно в исходное окно изображения и выберите режим в реальном времени и найдите область, которая была просто нацелена на корректировку фокусировки.

- Хорошим признаком успешной травмы является появление небольшого кратера, кольцевой конструкции или локализованного мусора прямо на месте повреждения.

- Теперь аккуратно снимите крышку скольжения, и перенесите поврежденную личинку на новую тарелку с дрожжевой пастой. Положите тарелку в 60-миллиметровую тарелку вместе с пропионовой кислотой пропитанной тканью. Затем верните тарелку к культовой температуре.

Для последующего изображения личинки, использовать сохраненные конфокальные установки и собирать z стек изображения с 25x цели. Не забудьте включить точку нормализации, чтобы регенерация может быть количественно.