Двухфотонное лазерное повреждение нервной системы: метод наблюдения за дегенерацией и регенерацией аксонов у личинок дрозофил

- Начните с того, что поместите чистую личинку под наркозом под стеклянную крышку головой вверх. Затем обнажите интересующую область, осторожно надавливая на крышку, чтобы свернуть личинку и отрегулировать ее положение. Используйте конфокальную визуализацию для определения местоположения нервных клеток личинок. Определите определенный аксон на одной из целевых нервных клеток в качестве места повреждения.

Затем подвергните аксон-мишень воздействию двухфотонного лазера с более высокой мощностью, чем используется для визуализации, чтобы вызвать повреждение. Двухфотонный лазер используется благодаря своей способности проникать и точно локализовать повреждения в живых тканях с минимальным повреждением окружающих тканей.

Немедленно прекратите лазерное воздействие при повреждении целевого нейрона, что приведет к аксотомии или разрыву аксона. Наконец, визуализируйте поврежденный нейрон, чтобы увидеть его дегенерацию и последующую регенерацию в желаемые моменты времени.

В примере протокола мы установим личинку для микроскопии, индуцируем повреждение сенсорных нейронов личинок и будем отслеживать регенерацию нейронов.

- Начните с обезболивания личинок. В вытяжном шкафу поместите 60-миллиметр