Två-foton laserinducerad neural skada: En metod för att observera Axon degeneration och regenerering i Drosophila Larver

- Börja med att montera en ren, bedövad larva under en glaskåpa med huvudet uppåt.

Exponera sedan målaxonen för en två-fotonlaser med högre effekt än vad som används för avbildning för att inducera skada.

Stoppa laserexponeringen omedelbart när det finns skador på målneuron, vilket resulterar i axotomi eller avskiljning av axonen. Slutligen, avbilda den skadade neuronen för att se dess degeneration och efterföljande regenerering vid önskade tidpunkter.

I exempelprotokollet kommer vi att montera en larva för mikroskopi, inducera skador på larvsensoriska nervceller och spåra neural regenerering.

- Börja med en bedövande larverna. I en rökhuv, placera en 60-millimeters glasform i en 15 centimeter plast petriskål. Vik sedan en bit vävnadspapper och lägg det i glasfatet. Placera druvagarplattan på vävnaden efter att dietyletern har tillsatts.

Placera sedan en droppe halokarbon 27-olja i mitten på en glasrutschbana och placera en fläck vakuumfett på vart och ett av de fyra hörnen.

Använd sedan mild kraft för att skjuta täckspillningen för att rulla cellerna som ska ablated till där två-fotonlasern kommer att slå dem lättast.

I programvaran, växla till skanningsläget och ladda det sparade protokollet. Se till att pinhole öppnas hela vägen.

Stoppa sedan live-skanningen så att beskärningsknappen blir tillgänglig. Med hjälp av beskärningsfunktionen justerar du skanningsfönstret för att fokusera målområdet på bara den potentiella skadeplatsen.

Växla sedan tillbaka till det ursprungliga bildfönstret och välj liveläge och hitta den region som just riktades genom att justera fokus.

- En bra indikation på lyckad skada är utseendet på en liten krater, ringliknande struktur eller lokaliserat skräp direkt på skadeplatsen.

- Ta nu försiktigt bort täckspäckan och överför den skadade larven på en ny tallrik med jästpasta. Lägg plattan i en 60 millimeters skål tillsammans med en propionsyradränkt vävnad.

För efterföljande avbildning av larven, använd den sparade konfokala installationen och samla z stack-bilder med ett 25x-mål. Var noga med att inkludera normaliseringspunkten så att regenereringen kan kvantifieras.