İki Foton Lazer Kaynaklı Nöral Yaralanma: Drosophila Larvalarında Akson Dejenerasyonu ve Yenilenmesini Gözlemleme Yöntemi

- Temiz, uyuşturulmış bir larvayı başı yukarıda bir cam kapak kaymasının altına monte ederek başlayın. Daha sonra, larvayı yuvarlamak ve konumunu ayarlamak için kapak kaymasını hafifçe iterek ilgi alanını ortaya çıkarın. Larva sinir hücrelerini bulmak için konfokal görüntüleme kullanın. Hedef sinir hücrelerinden birinde yaralanma yeri olarak belirli bir akson tanımlayın.

Daha sonra hedef aksonu, hasara neden olmak için görüntüleme için kullanılandan daha yüksek bir güçte iki fotonlu bir lazere maruz bırakın. İki fotonlu bir lazer, canlı dokudaki hasarı çevre dokuya en az hasarla nüfuz etme ve hassas bir şekilde lokalize etme yeteneği nedeniyle kullanılır.

Hedef nöronda hasar olduğunda lazer maruziyetini hemen durdurun, bu da aksonun aksotomisine veya kesilmesine neden olur. Son olarak, yaralı nöronu dejenerasyonunu ve ardından istenen zaman noktalarında yenilenmesini görüntülemek için görüntüleyin.

Örnek protokolde, mikroskopi için bir larva monte edeceğiz, larva duyusal nöronlara zarar vereceğiz ve nöral yenilenmeyi takip edeceğiz.

- Larvaları uyuşturarak başlayın. Dumanlı bir davlumbazın içine 15 santimetrelik plastik petri kabına 60 milimetrelik bir cam kabı yerleştirin. Daha sonra bir parça kağıt katlayın ve cam kabın içine yerleştirin. Dietil eter eklendikten sonra üzüm agar plakasını dokuya yerleştirin.

Sonra, cam bir slayt yerine bir damla halocarbon 27 yağı ortada, ve dört köşenin her birine bir vakum yağı yerleştirin. Daha sonra bir larvayı agar plakasına aktarmak için tokmak kullanın ve larvayı uyuşturmak için cam kabı örtün. Lav hareket etmeyi bırakır bırakmaz, başı dik olarak halokarbon yağına dikkatlice aktarın.

Daha sonra, iki fotonlu lazerin en kolay vuracağı yere ablated hücreleri yuvarlamak için kapak kaymasını kaydırmak için yumuşak kuvvet kullanın. Konum, hangi nöronların hedeflendiğine bağlı olarak değişecektir. Şimdi iki foton mikroskop aşamasında montajı sabitleyin ve 40x yağ daldırma hedefi kullanarak ilgi çekici hücrelere odaklanın.

Yazılımda, tarama moduna geçin ve kaydedilen protokolü yükleyin. Pinhole'un tamamen açıldığından emin olun. Ardından, canlı modda, ilgi çekici bölgenin iyi bir görüntüsünü alın.

Ardından, kırpma düğmesinin kullanılabilir olması için canlı taramayı durdurun. Kırpma işlevini kullanarak, hedef alanı sadece olası yaralanma bölgesine odaklamak için tarama penceresini ayarlayın. Sonra yeni bir görüntüleme penceresi açın. Şimdi tarama hızını azaltın ve lazer yoğunluğunu artırın. Ardından taramayı başlatmak ve durdurmak için sürekli düğmeyi açın. Dikkatlice izleyin. Floresanda ciddi bir artış olduğu anda taramayı sonlandırın.

Ardından, orijinal görüntüleme penceresine geri dönün ve canlı modu seçin ve odağı ayarlayarak hedeflenen bölgeyi bulun.

- Başarılı yaralanmanın iyi bir göstergesi, yaralanma bölgesinin hemen üzerinde küçük bir krater, halka benzeri bir yapı veya lokalize kalıntıların ortaya çıkmasıdır. Lazer gücü çok yüksek olsaydı, ölümcül olabilecek büyük bir hasarlı alan görünür olurdu.

- Şimdi kapak kaymasını dikkatlice çıkarın ve yaralı larvayı maya macunu ile yeni bir tabağa aktarın. Plakayı propiyonik asitle ıslatılmış bir doku ile birlikte 60 milimetrelik bir tabağa koyun.

Larvaların sonraki görüntülemesi için, kaydedilen konfokal kurulumu kullanın ve 25x hedefi olan z yığını görüntülerini toplayın. Rejenerasyonun ölçülebilmesi için normalleştirme noktasını ekleyin.