Secagem Química: Preparação biológica da amostra para microscopia eletrônica de varredura (SEM)

- Para começar, comece desidratando e secando uma amostra fixa para reduzir a distorção amostral causada pela remoção de gases e água líquida à pressão operacional reduzida dos microscópios eletrônicos convencionais de varredura, SEMs.

Para desidratar a amostra, lave-a com concentrações crescentes de etanol na água até que 100% de etanol seja atingido. Em seguida, repita esse processo com um agente de secagem química no etanol até que a amostra seja lavada com agente de secagem pura. Transfira a amostra e o agente de secagem para um prato de evaporação. Cubra-o com o mínimo de agente de secagem adicional e deixe-o secar em um capô de fumaça durante a noite.

Em seguida, monte a amostra preparada na parte superior de um microscópio usando fita adesiva de carbono. Por fim, aplique tinta prateada nas bordas do stub, depois da borda do stub para cada uma das amostras, para reduzir o acúmulo de elétrons em excesso, o que poderia resultar em artefatos de imagem indesejáveis.

Neste experimento, as moscas-das-frutas, Drosophila melanogaster, são preparadas para análise sem utilizando o agente de secagem HMDS.

- Para preparar drosophila melanogaster, imersão moscas anestesiadas em 1 mililitro de fixitive por 2 horas a 4 graus Celsius, certificando-se de que estão completamente submersas.

Use uma pipeta de vidro para remover o fixitive. Lave a amostra de Drosophila fixa em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro três vezes com 1 mililitro de 0,1 tampão de fosfato molar pH 7,2 em temperatura ambiente por 10 minutos. Use uma pipeta de vidro para remover cada lavagem, tomando cuidado para não remover a amostra.

Em seguida, desidrateir a amostra em um tubo de microfuge, em um volume de 1 mililitro, usando uma série de etanol de grau por 10 minutos cada. Use uma pipeta de vidro para remover cada lavagem, tomando cuidado para não remover a amostra. Mantenha a amostra no tubo de microcentrífusuga de 1,5 mililitro com apenas 100% de etanol suficiente para cobri-la.

Para realizar a secagem química das moscas usando o HMDS, primeiro, substitua a solução 100% etanol por uma solução de 1 a 2 de HMDS e 100% etanol por 20 minutos. Em seguida, substitua a solução por uma solução de 2 a 1 de HMDS e 100% etanol por 20 minutos.

Transfira a amostra, que está em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro e HMDS, em um prato de pesagem de alumínio descartável. Substitua o HMDS 100% com apenas 100% HMDS fresco suficiente para cobrir a amostra. Coloque a amostra dentro do prato de alumínio diretamente em uma capa de fumaça química para secar com uma tampa solta, como uma caixa, para evitar que os detritos caiam sobre a amostra, e deixe-a secar por 12 a 24 horas.

Para montar drosophila rotule a parte inferior de um stub de montagem de alumínio. Use pinças de precisão para colocar as moscas secas na posição desejada em uma guia adesiva de carbono presa ao topo de um stub sob um microscópio dissecando. Aplique adesivo condutor de prata ao redor das bordas externas das pontas dos stubbs.

Use um palito para conectar a tinta prateada às moscas, garantindo condutividade, certificando-se de que a tinta não toque na área de imagem desejada. Coloque os stubs em uma caixa de suporte de stub. E, em seguida, coloque a caixa aberta em um desiccator e deixe a tinta prateada secar por pelo menos três horas.