Kemisk torkning: Biologisk provberedning för scanning av elektronmikroskopi (SEM)

- Börja med att dehydrera och torka ett fast prov för att minska provförvrängningen som orsakas av avlägsnande av gaser och flytande vatten vid det minskade driftstrycket av konventionella scanningelektronmikroskop, SEMs.

För att dehydrera provet, tvätta det med ökande koncentrationer av etanol i vatten tills 100% etanol uppnås. Upprepa sedan denna process med ett kemiskt torkmedel i etanol tills provet tvättas med rent torkmedel. Överför provet och torkmedlet till en avdunstningsform.

Montera sedan det beredda provet på toppen av ett mikroskopstubbe med hjälp av kollimtejp. Slutligen applicera silverfärg på kanterna på stubben, sedan från kanten av stubben till vart och ett av proverna, för att minska ansamlingen av överflödiga elektroner, vilket kan resultera i oönskade bildartefakter.

I detta experiment är fruktflugor, Drosophila melanogaster, beredda för SEM-analys med torkmedlet HMDS.

- För att förbereda Drosophila melanogaster, sänk ner bedövade flugor i 1 milliliter fixitiv i 2 timmar vid 4 grader Celsius, se till att de är helt nedsänkta.

Använd en glaspipett för att ta bort fixitiven. Tvätta det fasta Drosophila-provet i ett 1,5 milliliter mikrocentrifugrör tre gånger med 1 milliliter 0,1 molarfosfatbuffert pH 7,2 vid rumstemperatur i 10 minuter. Använd en glaspipett för att ta bort varje tvätt, var försiktig så att provet inte tas bort.

Torka sedan provet i ett mikrofugerör, i en volym av 1 milliliter, med hjälp av en graderad etanolserie i 10 minuter vardera. Använd en glaspipett för att ta bort varje tvätt, var försiktig så att du inte tar bort provet.

För att utföra kemisk torkning av flugorna med HMDS först, ersätt 100% etanollösning med en 1 till 2-lösning av HMDS och 100% etanol i 20 minuter. Byt sedan ut lösningen mot en 2 till 1 lösning av HMDS och 100% etanol i 20 minuter. Slutligen ersätt denna lösning med 100% HMDS i 20 minuter och upprepa sedan processen en gång.

Överför provet, som finns i ett mikrocentreringsrör på 1,5 milliliter och HMDS. i en engångsskål av aluminiumvägning. Byt ut 100% HMDS mot precis tillräckligt med färsk 100% HMDS för att täcka provet.

För att montera Drosophila etikett botten av en aluminium montering stub. Använd precision pincett för att placera de torkade flugorna i önskat läge på en kollim flik fastsatt på toppen av en stub under ett dissekerande mikroskop. Applicera silver ledande lim runt stubbens ytterkanter.

Använd en tandpetare för att ansluta silverfärgen till flugorna, säkerställa konduktivitet, se till att färgen inte vidrör det önskade bildområdet.