Der CApillary FEeder (CAFE) Assay: Eine Methode, um den Verzehr von Lebensmitteln und die Präferenz in Drosophila zu verfolgen

- Zur Vorbereitung für den Capillary Feeder, oder CAFE Assay, setzen Sie abgestufte oder markierte Glaskapillaren gefüllt mit farbigen, flüssigen Lebensmitteln, unten ende zuerst, durch die Pipettenspitzen auf der Oberseite einer vormontierten experimentellen Durchstechflasche. Stellen Sie sicher, dass die Kapillaren sicher in der gleichen Höhe platziert werden und sind nicht in Kontakt mit dem Gerät.

Markieren Sie die Ausgangsstufe des Meniskus in jeder Kapillare. Dann beherbergen Sie die Fläschchen in einer temperatur-, feuchtigkeits- und lichtgesteuerten Umgebung für die Dauer des Experiments und ersetzen die Kapillaren nach Bedarf. Während des CAFE-Assays sind mobile Fliegen hemmungslos und haben freien Zugang zum unteren offenen Ende der Mikropipette. Fliegen ernähren sich freiwillig, während sie ihre Proboscis ausdehnen und die Flüssigkeit aufnehmen, wodurch das Medium im Inneren der Kapillare reduziert wird.

Um den Verzehr von Lebensmitteln und die Vorliebe für einen festgelegten Zeitraum zu verfolgen, notieren Sie den Abstieg des Meniskus von der Startmarke auf das Niveau am Ende dieses Zeitraums von qualifizierenden Kapillaren. Im Beispielprotokoll werden wir den CAFE-Assay mit der Montage sehen, der modifiziert wurde, um eine reduzierte Verdunstung aus den flüssigkeitsgefüllten Kapillaren zu erreichen.

- Entfernen Sie vorsichtig die Pipettenspitze, die eine der äußeren Öffnungen schließt, und legen Sie eine gefüllte Glaskapillare, unteres Ende zuerst. Sichern Sie die Kapillare, indem Sie die Pipettenspitze wieder neben die Kapillare. Wiederholen Sie diesen Schritt für alle getesteten Lebensmittellösungen.

Als nächstes legen Sie die Kapillarenen den Fläschchen in allen Fläschchen auf der gleichen Ebene, 3 bis 4 Zentimeter vom Deckel. Lassen Sie einen gewissen Abstand zwischen dem Filterpapier, um zu verhindern, dass die Kapillare undicht wird. Verwenden Sie einen Markerstift, um das obere Ende der farbigen Flüssigkeit zu beschriften. Beschriften Sie sie einzeln mit einem Streifencode, um sicherzustellen, dass die verschiedenen Kapillaren identifiziert werden können.

Legen Sie vorbereitete CAFE-Assays in eine Plastikbox mit gegitterter Inlay. Verwenden Sie einen Schwamm-Bung, um 100 Mikroliter Frischwasser alle 24 Stunden aufzutragen, um die Luftfeuchtigkeit im Test konstant zu halten. Verwenden Sie vier separate Fläschchen, die mit 30 Millilitern doppelt destilliertem H2O gefüllt sind, als Feuchtigkeitsgeräte und legen Sie sie neben die CAFE-Assays in die Plastikbox.

Bedecken Sie die Kunststoffbox, um während des Experiments eine feuchtigkeitsgesteuerte Umgebung zu schaffen. Übertragen Sie die Box in eine sichere Position in einer temperatur-, licht- und feuchtigkeitsgesteuerten Klimakammer für den Versuchszeitraum. Notieren Sie sich vor jedem 24-Stunden-Intervall die toten Fliegen und verwenden Sie die Anzahl der lebenden Fliegen, um den Verbrauch pro Fliege für den folgenden Zeitraum zu berechnen.

Am Ende des Assays und vor dem Austausch der Kapillare, halten Sie den CAFE-Assay in der aufrechten Position. Entfernen Sie nicht den Deckel und markieren Sie den unteren Meniskus der Kapillare. Entsorgen Sie die Daten, wenn das Markierungsende nicht unter der Anfangsmarke liegt. Ersetzen Sie die verwendeten Kapillaren durch frisch gefüllte Kapillaren für Langzeitexperimente alle 24 Stunden.

Messen Sie den Rückgang des Meniskus. Dann entsorgen Sie die alten Kapillaren. Entfernen Sie dann vorsichtig die Kapillaren aus dem Test und speichern Sie sie für die Datensammlung. Prüfen Sie, ob die Flüssigkeit in der Kapillare das untere Ende erreicht hat. Wenn die Flüssigkeit in der Kapillare nicht das untere Ende erreicht hat, entsorgen Sie die Daten.

Nach dem Experiment demontieren Sie das Setup und waschen Sie die Fläschchen, Deckel und Schwamm-Bungs in einem Seifenbad. Trocknen Sie sie dann über Nacht bei Raumtemperatur für die weitere Verwendung. Wiederholen Sie Experimente mit den gleichen Genotypen an mindestens drei verschiedenen Tagen. Messen Sie mit einem Bremssattel den Abstand zwischen Mark-Anfang und Mark-Ende auf der Kapillare. Schließlich entsorgen Sie die Kapillaren nach der Messung.