De CApillary FEeder (CAFE) Assay: Een methode om voedselconsumptie en voorkeur in Drosophila te volgen

- Om zich voor te bereiden op de Capillary Feeder, of CAFE-test, plaatst u gesorteerde of gemarkeerde glazen haarvaten gevuld met gekleurd, vloeibaar voedsel, eerst aan de onderkant, via de pipetpunten bovenop een voorgemonteerde experimentele flacon. Zorg ervoor dat de haarvaten stevig op dezelfde hoogte zijn geplaatst en niet in contact komen met het apparaat.

Markeer het beginniveau van de meniscus in elk capillair. Plaats de flacons vervolgens in een temperatuur-, vochtigheids- en lichtgecontroleerde omgeving voor de duur van het experiment, terwijl de haarvaten indien nodig worden vervangen. Tijdens de CAFE-test worden mobiele vliegen ongeremd en hebben ze vrije toegang tot het onderste open uiteinde van de micropipet. Vliegen voeden zich vrijwillig terwijl ze hun slurf verlengen en de vloeistof opnemen, waardoor het medium in het capillair wordt verminderd.

Om de voedselconsumptie en de voorkeur voor een bepaalde periode bij te houden, registreert u de afdaling van de meniscus van het beginteken naar het niveau aan het einde van die periode van in aanmerking komende haarvaten. In het voorbeeldprotocol zien we de CAFE-test met de assemblage aangepast om een verminderde verdamping van de met vloeistof gevulde haarvaten te bereiken.

- Verwijder voorzichtig de pipettip die een van de buitenste openingen sluit en plaats eerst een gevuld glazen capillair, het onderste uiteinde. Zet het capillair vast door de pipettip terug naast het capillair te plaatsen. Herhaal deze stap voor alle geteste voedseloplossingen.

Plaats vervolgens de capillaire uiteinden in alle flacons op hetzelfde niveau, op 3 tot 4 centimeter van het deksel. Laat enige afstand tussen het filterpapier om te voorkomen dat het capillair lekt. Gebruik een markeerstift om het bovenste uiteinde van de gekleurde vloeistof te labelen. Label ze afzonderlijk met behulp van een streepcode om ervoor te zorgen dat de verschillende haarvaten kunnen worden geïdentificeerd.

Doe voorbereide CAFE-assays in een plastic doos met een roosterinleg. Gebruik een sponsbung om elke 24 uur 100 microliter vers water aan te brengen om de luchtvochtigheid constant te houden in de test. Gebruik vier afzonderlijke flacons gevuld met 30 milliliter dubbel gedestilleerde H2O als vochtigheidsapparaten en plaats ze naast de CAFE-assays in de plastic doos.

Bedek de plastic doos om een vochtigheidsgecontroleerde omgeving te creëren tijdens het experiment. Breng de doos over naar een veilige positie in een temperatuur-, licht- en vochtigheidsgecontroleerde klimaatkamer voor de experimentele periode. Noteer vóór elk interval van 24 uur de dode vliegen en gebruik het aantal levende vliegen om het verbruik per vlieg voor de volgende periode te berekenen.

Aan het einde van de test en voordat u het haarvat vervangt, houdt u de CAFE-assay rechtop. Verwijder het deksel niet en markeer de onderste meniscus van het haarvat. Gooi de gegevens weg als het uiteinde van de markering niet onder de oorspronkelijke markering ligt. Vervang de gebruikte haarvaten door vers gevulde haarvaten voor langdurige experimenten om de 24 uur.

Meet de afname van de meniscus. Gooi vervolgens de oude haarvaten weg. Verwijder vervolgens voorzichtig de haarvaten uit de assay en bewaar ze voor het verzamelen van gegevens. Controleer of de vloeistof in het capillair het onderste uiteinde heeft bereikt. Als de vloeistof in het capillair het onderste uiteinde niet heeft bereikt, gooi de gegevens dan weg.

Na het experiment, demonteer de opstelling en was de flacons, deksels en spons bungs in een zeepbad. Droog ze vervolgens 's nachts op kamertemperatuur voor verder gebruik. Herhaal experimenten met dezelfde genotypen op ten minste drie verschillende dagen. Meet met behulp van een remklauw de afstand tussen mark-beginning en mark-end op het capillair. Gooi ten slotte de haarvaten weg na de meting.