Dissecção da glândula linfática larval: Isolando o Órgão Produtor de Hemócitos de Drosophila

- A glândula linfática larval Drosophila melanogaster é responsável pela produção de hemócitos, ou células sanguíneas, que circulam no hemoglifo larval. Para identificar a glândula linfática, primeiro encontre o vaso dorsal, ou coração, que bombeia hemoglifos por todo o corpo. Siga o vaso dorsal em direção à cabeça até encontrar o cérebro.

Para encontrar o lobo primário, identifique o maior lobo da glândula. Este lobo contém três zonas, definidas por diferentes estágios de desenvolvimento de hemócitos. A zona medular mais próxima do vaso dorsal contém hemócitos imaturos, enquanto a zona cortical contém hemócitos maduros. Na extremidade posterior do lobo primário, você pode encontrar o centro de sinalização posterior, composto por hemócitos especializados.

Para dissecar a glândula linfática, você precisará de um microscópio dissecador, dois fórceps para manipular as larvas e uma solução salina tamponada.

Neste exemplo, dissecaremos glândulas linfáticas para uso em imunohistoquímica.

- Para iniciar a dissecção da glândula linfática, adicione 1 mililitro de 1x PBS a 1 poço de uma placa de 24 poços para cada configuração experimental a ser dissecada. Em seguida, usando uma pipeta de transferência descartável, adicione 1 gota de 0,1% PBST a cada poço. Coloque a placa plana no gelo. Coloque uma almofada de dissecação limpa em uma base estereoscópio iluminada. Use uma pipeta de transferência descartável para colocar uma queda de 0,01% PBST sobre a almofada.

Transfira uma larva para a gota PBST para dissecção. Segure a lava com um par de fórceps, lado dorsal para cima, aproximadamente 1/4 de comprimento da extremidade posterior. Com o segundo par de fórceps, pegue a cutícula imediatamente anterior ao primeiro par e puxe suavemente a cutícula larval em direção ao anterior, até que os ganchos da boca sejam expostos.

Solte a cutícula e use as duas fórceps para bissecção da larva. Remova a extremidade posterior da gota e descarte do PBST. Coloque a cutícula para estabilidade e, em seguida, use o segundo par de fórceps para pegar os ganchos da boca expostos e puxá-los suavemente para fora.

Mantendo os ganchos da boca, remova cuidadosamente estruturas indesejadas, como as glândulas salivares, o corpo de gordura e o intestino. Pegue suavemente o complexo tecidual dissecado pelos ganchos da boca e transfira-o para um poço da placa no gelo. Repita a dissecção com quantas larvas desejar, mas não exceda um tempo de dissecção de 30 minutos antes de prosseguir para a etapa de fixação.

Para iniciar a montagem do tecido, coloque uma gota de tampão de montagem em uma lâmina de vidro. Usando os ganchos da boca como alça, transfira a glândula linfática para a gota de tampão. Espaça os tecidos uniformemente, espalhando o tampão de montagem no processo.

Deslize cuidadosamente uma pinça dos fórceps sob o vaso dorsal, puxando suavemente em direção à periferia do tampão de montagem para retirar e achatar a glândula linfática. Com um movimento de serragem, corte o vaso dorsal entre a glândula linfática e o cérebro. Mova o resto dos tecidos para longe da glândula linfática para a borda mais externa do tampão.

Pegue um deslizamento de cobertura limpo e abaixe-o cuidadosamente sobre o tampão de montagem. Os slides estão agora prontos para imagem ou podem ser armazenados a 4 graus Celsius até que seja necessário.