Preparação de Oócitos de Drosophila Fixo para Imunostaining: Um Método de Alto Rendimento para Fixar e Remover a Membrana Externa

- Comece pulsando drosophila anestesiada junto com tampão em um liquidificador para quebrar moscas em pequenos pedaços. Filtrar a mistura através de uma malha para remover as grandes partes do corpo. Em seguida, deixe os ovos afundarem enquanto os fragmentos maiores permanecem na superfície e podem ser removidos.

Repita este processo usando uma malha menor para remover detritos adicionais. Recolher os ovos em um frasco, e se os ovos forem tratados com uma droga, faça-o neste momento. Em seguida, remova o líquido e substitua-o por fixativo. Adicione heptano para ajudar a penetrar fixante na membrana ao redor do ovo.

Em seguida, lave o fixador com PBS. Para colorir os oócitos, remova as membranas externas protetoras para permitir a penetração de anticorpos. Pipeta os oócitos na parte fosca de um escorregador de vidro. Coloque uma mancha sobre os ovos e role suavemente o deslizamento em um movimento de ida e volta para separar mecanicamente a membrana de acorde e vitellina do ovo.

No protocolo de exemplo, estaremos preparando oócitos em meiose I para manchar e visualizar o aparelho de fuso.

- Para começar, pré-corte o interior de um tubo de 5 mililitros e pipeta Pasteur com PTB para evitar que os oócitos grudem nas superfícies. Adicione 100 mililitros do tampão de Rob a um liquidificador e, em seguida, adicione 100 a 300 moscas anestesiadas e pulso três vezes por um segundo.

Filtre o chorume resultante em um béquer de 250 mililitros através de uma grande malha com poros de cerca de 1500 micrômetros. Deixe o filtrado se contentar por cerca de dois minutos e, em seguida, aspire a camada superior, removendo o maior número possível de partes grandes do corpo.

Enxágüe o primeiro béquer usando tampão adicional na pipeta revestida para coletar os oócitos restantes. Deixe o chorume se acomodar por três minutos e depois aspire todos, exceto os 10 mililitros inferiores. Despeje o máximo possível de 10 mililitros no tubo revestido de 5 mililitros.

Adicione o restante dos 10 mililitros de chorume e deixe a mistura se acomodar novamente antes de remover o líquido. Enxágue todos os oócitos restantes do béquer usando tampão adicional na pipeta revestida. Deixe a lavagem se instalar no tubo de 5 mililitros por três a cinco minutos.

Para fixar os ovários, primeiro, aspire todo o líquido dos tecidos, e adicione imediatamente 1 mililitro de mistura de correção. Coloque os tecidos em um nutador por dois minutos e meio. Em seguida, adicione 1 mililitro de heptano, vórtice do tubo por um minuto e, em seguida, deixe os oócitos se acomodarem por mais um minuto.

Remova todo o líquido do tecido assentado, depois adicione 1 mililitro de 1x PBS. Vortex o tubo por 30 segundos, e então deixe os oócitos se contentarem por um minuto. Depois disso, remova todo o líquido do tubo e encha-o com cinco mililitros de 1x PBS.

Usando a pipeta revestida, adicione cerca de 500 a 1.000 oócitos a um deslizamento de vidro fosco. Remova quaisquer partes ou material do corpo extrainoso usando fórceps. Coloque uma mancha de cobertura em cima do tecido, e role suavemente os oócitos até que todas as membranas sejam removidas.