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Encyclopedia of Experiments: Biology

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드로소필라 인 비보 칼슘 이미징

 
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드로소필라 인 비보 칼슘 이미징: 신경 활동의 기능적 이미징 방법

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- Drosophila 신경계에서 생체칼슘 이미징을 수행하기 위해 GCaMP와 같은 유전자 인코딩 된 칼슘 지표의 발현을 관심있는 뉴런으로 타겟팅합니다.

GCaMP는 향상된 녹색 형광 단백질, 또는 EGFP가 N-종기에서 미오신 광사슬의 M13 단편에 변형및 융합되는 융합 단백질이며, 칼슘 결합 단백질인 칼모둘린은 칼모둘린에 결합하여 칼모둘린에 결합하여 GCaMP의 단백질 변화를 유발한다.

GCaMP 형광의 변화를 생체 내의 뉴런 활성의 대리자로 이미지하기 위해, 예상 활동으로 신경계의 영역을 노출. 다음, GCaMP 역학을 캡처할 있고 자극 전달 설정을 장착한 형광 현미경을 사용합니다.

예제 프로토콜에서, 우리는 GCaMP 기능적인 화상 진찰이 후각 연관 학습 도중 두뇌의 버섯 바디에 있는 반응을 구상하기 위하여 이용되는 것을 볼 것입니다.

- GFP 기반 칼슘 지표의 시각화를 위해 적외선 레이저와 수질 침수 목표를 갖춘 다광현미경의 레이저를 조정하고, 진동 분리 테이블에 설치, 920 나노미터의 외발 파장에, GFP 밴드 패스 필터를 설치. 거친 Z 조정 노브를 사용하여, 관심의 영역을 찾기 위해 뇌의 z 축을 통해 스캔. 작물 기능을 사용하여 스캔 시간을 최소화하기 위해 관심 영역만에 스캔을 집중하고, 헤드의 전방을 향한 스캔 보기를 회전. 512x512 픽셀로 크기를 조정하고 스캔할 영역을 선택하여 프레임에 대해 계산된 스캔 시간을 고려하여 최소 4Hertz의 프레임 속도를 달성합니다.

악취 유발 칼슘 과도 시각화의 경우 이미지 획득 소프트웨어 악취 전달 프로그램을 연결할 수 있는 미리 프로그래밍된 매크로 패키지를 시작하고 6.25초 동안 현미경 소프트웨어에서 측정을 시작하여 F0 기준값을 설정합니다. 악취 전달 시스템에서는, 2.5초 악취 자극을 전달하여, 특정 악취 밸브의 개폐에 의해 유발되는 LED의 조명에 의해 여기에 표시되고, 악취 오프셋의 끝에 12.5초의 기록이 뒤따릅니다.

설정에서 연관 컨디셔닝을 수행하려면 컴퓨터 제어 악취 전달 시스템을 사용하여 12 90볼트 감전과 함께 60초 동안 조절된 자극과 냄새를 제시합니다. 60초 휴식 후, 감전 없이 60초 동안 단독으로 소취를 상태 자극을 제시하였다.

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