Encyclopedia of Experiments: Biology
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- Drosophila 신경계에서 생체 내 칼슘 이미징을 수행하기 위해 GCaMP와 같은 유전자 인코딩 된 칼슘 지표의 발현을 관심있는 뉴런으로 타겟팅합니다.
GCaMP는 향상된 녹색 형광 단백질, 또는 EGFP가 N-종기에서 미오신 광사슬의 M13 단편에 변형및 융합되는 융합 단백질이며, 칼슘 결합 단백질인 칼모둘린은 칼모둘린에 결합하여 칼모둘린에 결합하여 GCaMP의 단백질 의 변화를 유발한다.
GCaMP 형광의 변화를 생체 내의 뉴런 활성의 대리자로 이미지하기 위해, 예상 활동으로 신경계의 영역을 노출. 다음, GCaMP 역학을 캡처할 수 있고 자극 전달 설정을 장착한 형광 현미경을 사용합니다.
예제 프로토콜에서, 우리는 GCaMP 기능적인 화상 진찰이 후각 연관 학습 도중 두뇌의 버섯 바디에 있는 반응을 구상하기 위하여 이용되는 것을 볼 것입니다.
- GFP 기반 칼슘 지표의 시각화를 위해 적외선 레이저와 수질 침수 목표를 갖춘 다광현미경의 레이저를 조정하고, 진동 분리 테이블에 설치, 920 나노미터의 외발 파장에, GFP 밴드 패스 필터를 설치. 거친 Z 조정 노브를 사용하여, 관심의 뇌 영역을 찾기 위해 뇌의 z 축을 통해 스캔. 작물 기능을 사용하여 스캔 시간을 최소화하기 위해 관심 영역만에 스캔을 집중하고, 헤드의 전방을 향한 스캔 보기를 회전. 512x512 픽셀로 크기를 조정하고 스캔할 영역을 선택하여 각 프레임에 대해 계산된 스캔 시간을 고려하여 최소 4Hertz의 프레임 속도를 달성합니다.
악취 유발 칼슘 과도 시각화의 경우 이미지 획득 소프트웨어 및 악취 전달 프로그램을 연결할 수 있는 미리 프로그래밍된 매크로 패키지를 시작하고 6.25초 동안 현미경 소프트웨어에서 측정을 시작하여 F0 기준값을 설정합니다. 악취 전달 시스템에서는, 2.5초 악취 자극을 전달하여, 특정 악취 컵 밸브의 개폐에 의해 유발되는 LED의 조명에 의해 여기에 표시되고, 악취 오프셋의 끝에 12.5초의 기록이 뒤따릅니다.
이 설정에서 연관 컨디셔닝을 수행하려면 컴퓨터 제어 악취 전달 시스템을 사용하여 12 90볼트 감전과 함께 60초 동안 조절된 자극과 냄새를 제시합니다. 60초 휴식 후, 감전 없이 60초 동안 단독으로 소취를 뺀 상태 자극을 제시하였다.
