एकल कृमि पीसीआर: जीनोमिक डीएनए को निकालने और बढ़ाने के लिए एक विधि

- एकल कृमि पीसीआर विश्लेषण के लिए, एक हर्मेफ्रोडिट कीड़ा को स्वयं को उपजाऊ बनाने और अंडे डालने की अनुमति दें जो आनुवंशिक रूप से समान संतान पैदा करेंगे और इसलिए, संशोधित तनाव की एक प्रति को संरक्षित करें। फिर, माता-पिता को कृमि लाइसिस बफर युक्त ट्यूब में स्थानांतरित करें।

क्यूटिकल या बाहरी परत को खोलने के लिए ट्यूब को शून्य से 80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें। 60 डिग्री सेल्सियस के नमूने को गर्म करने के लिए कोशिका के जीनोमिक डीएनए के साथ इंट्रासेलुलर प्रोटीन जारी करने वाले कीड़ा कोशिकाओं को lyse करने के लिए । इस तापमान पर, बफर के भीतर प्रोटीन के रूप में प्रोटीन, विशेष रूप से नाभिक है कि अंयथा जीनोमिक डीएनए को नष्ट कर देता है ।

इसके बाद एंजाइम को निष्क्रिय करने के लिए तापमान को 95 डिग्री सेल्सियस तक बढ़ा दें। - अंत में, पीसीआर मास्टर मिक्स के साथ एक ट्यूब में सेल को जोड़ें, जिसमें रुचि के क्षेत्र के लिए रिएक्शन बफर, डीएनटीपीएस, फॉरवर्ड और रिवर्स प्राइमर, टैक पॉलीमरेज और पानी के क्षेत्र के लिए एक वांछित अंतिम मात्रा में प्रतिक्रिया लाने के लिए बनाया गया है । पीसीआर को चलाने के लिए, उपयुक्त थर्मल चक्र कार्यक्रम चलाएं जो रुचि के डीएनए क्षेत्र को बढ़ाता है ।

निम्नलिखित उदाहरण में, हम एकल F1 कीड़े के जीनोमिक डीएनए में CRISPR-Cas9 संपादन घटनाओं के लिए स्क्रीन करने के लिए एक पीसीआर प्रक्रिया देखेंगे।

- अंडा बिछाने के 1 से 2 दिनों के बाद, एक वर्म पिक का उपयोग करें एफ 1एस को व्यक्तिगत पीसीआर स्ट्रिप ट्यूब कैप में स्थानांतरित करने के लिए जिसमें गर्म लाइसिस बफर के 7 माइक्रोलीटर होते हैं। जानवरों को ट्यूब के नीचे लाने के लिए एक मिनट के लिए अधिकतम गति और कमरे के तापमान पर पीसीआर ट्यूबों को सेंट्रलाइज करें।

इसके बाद, निम्नलिखित कार्यक्रम का उपयोग करके थर्मल साइकिलर में जमे हुए कीड़े को ढूँढ़ते हैं। फिर, इस तालिका में दिखाए गए पीसीआर मास्टर मिश्रण की स्थापना करें।

पीसीआर मास्टर के 21 माइक्रोलीटर को साफ पीसीआर ट्यूब में मिलाएं। इसके बाद वर्म लाइसिस ट्यूब के 4 माइक्रोलीटर डालें और पाइपिंग करके अच्छी तरह से मिलाएं।

फिर, निर्माता के दिशानिर्देशों का पालन करते हुए पीसीआर कार्यक्रम चलाएं।