Placage RNAi pour l’alimentation de C. elegans : Une technique pour induire l’expression cible dsRNA dans E. coli

- Chez C. elegans, l’ARNi peut être induite par l’alimentation de bactéries vers qui expriment l’ARN double brin ou l’ARNd à partir d’un plasmide d’ADN recombinant.

Pour commencer, cultiver ht115 E. coli résistant à la tétracycline transfecté avec du plasmide L4440 pendant la nuit sur des plaques d’agar LB sélectives contenant de la tétracycline et de l’ampicilline, ou sa carbenicilline analogique fonctionnelle. En plus de l’ADN cible, le plasmide contient un gène de résistance à l’ampicilline. Seules les colonies bactériennes qui héritent du plasmide peuvent croître en présence de ces antibiotiques.

Ensuite, récoltez les colonies bactériennes et élargissez-les dans le milieu liquide de LB à la concentration désirée. Pour induire l’expression de dsRNA, transférez la solution de bactéries sur le milieu préparé de croissance de nématode, ou NGM, plaques d’agar contenant l’IPTG.

Dans ce système d’expression, iPTG imite le lactose pour inactiver le répresseur de lac permettant l’expression de la polymésase d’ARN T7. Sur le plasmide, l’expression cible de l’ADN est régulée par deux promoteurs convergents du T7. Par conséquent, les séquences de sens et d’anti-sens sont transcrites menant à l’expression de l’ARNd.

Enfin, le ver utilise l’information de séquence de l’ARNd ingéré pour réduire les ARNM endogènes avec des séquences complémentaires. Dans cette expérience, nous préparerons des plaques d’ARNi avec E. coli transgénique pour l’alimentation de C. elegans.

- Pour les plaques RNAi, chargez des plaques de 6 centimètres avec de l’agar NGM contenant de l’IPTG et de la carbenicilline. Laissez-les sécher pendant 24 à 48 heures à température ambiante dans l’obscurité. Ensuite, transférez-les à 4 degrés Celsius jusqu’à 14 jours.

Ensuite, stries plaques sélectives contenant de la carbenicilline et de la tétracycline avec des clones de bactéries RNAi avec plasmide L4440 portant le gène lin-53. Utilisez un modèle de stries en trois phases et assurez-vous de plaquer une lutte antivectorielle vide. Puis, faire pousser les plaques pendant la nuit à 37 degrés Celsius.

Le lendemain, choisissez au moins trois colonies uniques et inoculez chacune d’entre elles dans un tube de culture distinct avec 2 millilitres de LB complétés par de la carbenicilline, mais pas de la tétracycline. Prévoyez d’avoir trois cultures saines par condition.

Ensuite, cultivez les cultures du jour au lendemain à 37 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elles atteignent une densité optique à 600 nanomètres de 0,6 à 0,8. Puis, ajoutez 500 microlitres de chaque culture bactérienne à une plaque RNAi d’agar NGM de 6 centimètres. Incuber les plaques pendant la nuit à température ambiante dans l’obscurité.