Encyclopedia of Experiments: Biology
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- In C. elegans, RNAi può essere indotto alimentando batteri vermi che esprimono RNA o dsRNA a doppio filamento da un plasmide di DNA ricombinante.
Per iniziare, far crescere HT115 E. coli resistente alla tetraciclina trasfettato con plasmide L4440 durante la notte su piastre di agar LB selettive contenenti tetraciclina e ampicillina, o la sua carbenicillina analogica funzionale. Oltre al DNA bersaglio, il plasmide contiene un gene per la resistenza all'ampicillina. Solo le colonie batteriche che ereditano il plasmide possono crescere in presenza di questi antibiotici.
Successivamente, raccogliere le colonie di batteri ed espanderle in mezzo liquido LB alla concentrazione desiderata. Per indurre l'espressione di dsRNA, trasferire la soluzione batterica su un mezzo di crescita di nematodi preparato o NGM, piastre di agar contenenti IPTG.
In questo sistema di espressione, L'IPTG imita il lattosio per inattivare il repressore laco che consente l'espressione dell'RNA polimerasi T7. Sul plasmide, l'espressione del DNA bersaglio è regolata da due promotori convergenti di T7. Di conseguenza, le sequenze di senso e anti-senso sono trascritte portando all'espressione di dsRNA.
Infine, il verme utilizza le informazioni di sequenza dal dsRNA ingerito per deregolamentare gli mRNA endogeni con sequenze complementari. In questo esperimento prepareremo piastre RNAi con E. coli transgenico per l&alimentazione di C. elegans.
- Per le piastre RNAi, caricare piastre di 6 centimetri con agar NGM contenente IPTG e carbenicillina. Lasciarle asciugare per 24-48 ore a temperatura ambiente al buio. Quindi, trasferirle a 4 gradi Celsius per un massimo di 14 giorni.
Successivamente, piastre selettive striate contenenti carbenicillina e tetraciclina con cloni di batteri RNAi con plasmide L4440 che trasporta il gene lin-53. Utilizzare un modello di striature trifase e assicurarsi di placcare un controllo vettoriale vuoto. Quindi, far crescere le piastre durante la notte a 37 gradi Celsius.
Il giorno successivo, raccogliere almeno tre singole colonie e inocularle in un tubo di coltura separato con 2 millilitri di LB integrato con carbenicillina, ma non tetraciclina. Pianificare di avere tre colture sane per condizione.
Successivamente, far crescere le colture durante la notte a 37 gradi Celsius fino a raggiungere una densità ottica a 600 nanometri da 0,6 a 0,8. Quindi, aggiungere 500 microlitri di ogni coltura batterica a una piastra NGM agar RNAi di 6 centimetri. Incubare le piastre durante la notte a temperatura ambiente al buio.
