C. elegans Besleme için RNAi Kaplama: E. coli'de Hedef dsRNA İfadesini Teşvik Etmek İçin Bir Teknik

- C. elegans'ta RNAi, çift iplikli RNA veya dsRNA'yı ifade eden solucan bakterilerinin rekombinant DNA plazmidinden beslenmesi ile indüklenebilir.

Başlamak için, tetrasikline dirençli HT115 E. coli'yi tetrasiklin ve ampisilin içeren seçici LB agar plakalarında bir gecede L4440 plazmid veya fonksiyonel analog karbenisilin ile transkrome ettirin. Hedef DNA'ya ek olarak, plazmid ampisilin direnci için bir gen içerir. Sadece plazmid kalıtsal bakteri kolonileri bu antibiyotiklerin varlığında büyüyebilir.

Daha sonra, bakteri kolonilerini hasat edin ve sıvı LB ortamında istenen konsantrasyona genişletin. DSRNA ekspresyonuna neden olmak için, bakteri çözeltisini hazırlanmış nematod büyüme ortamına veya IPTG içeren NGM agar plakalarına aktarın.

Bu ifade sisteminde, IPTG, T7 RNA polimerazının ekspresyonunun etkinleştirilmesini sağlayan lac represörü devre dışı bırakmak için laktozu taklit eder. Plazmid üzerinde, hedef DNA ekspresyosu iki yakınsak T7 promotörü tarafından düzenlenir.

Son olarak, solucan, yutulan dsRNA'dan gelen sıra bilgilerini tamamlayıcı dizilerle endojen mRNA'ları küçültmek için kullanır. Bu deneyde, C. eleganların beslenmesi için transgenik E. coli ile RNAi plakaları hazırlayacağız.

- RNAi plakaları için, IPTG ve karbenisilin içeren NGM agar ile 6 santimetrelik plakalar yükleyin. Karanlıkta oda sıcaklığında 24 ila 48 saat kurumaya bırakın.

Daha sonra, lin-53 geni taşıyan L4440 plazmid ile RNAi bakteri klonları ile karbenisilin ve tetrasiklin içeren çizgi seçici plakalar. Üç fazlı bir çizgi deseni kullanın ve boş bir vektör kontrolünü plakaladığınızdan emin olun.

Ertesi gün, en az üç tek koloni seçin ve her birini karbenisilin ile desteklenmiş 2 mililitre LB ile ayrı bir kültür tüpüne aşılayın, ancak tetrasiklin değil.

Daha sonra, kültürleri 0,6 ila 0,8 arasında 600 nanometre optik yoğunluğa ulaşana kadar bir gecede 37 santigrat derecede büyütün.