Mikroinjektion von lebenden Drosophila-Embryonen: Frühe Lieferung von Reagenzien an den sich entwickelnden Embryo

- Sammeln Sie lebende Drosophila-Embryonen und entfernen Sie ihre intransparenten Krätzen. Dann, auf einem Glas-Abdeckungsslip, tragen Sie eine Linie von Heptan-Kleber, die Klebeband-Klebstoff in flüssigem Heptan gelöst ist. Um in der Lage, die jetzt dechorionierten Embryonen zu behandeln, richten Sie die Proben in einer Reihe sorgfältig auf den Klebstoff.

Übertragen Sie den Deckelinrutsch in eine Austrocknungskammer, um die Embryonen teilweise zu enttrocknen. Dadurch wird ein zytoplasmatisches Leck während oder nach Injektionen verhindert. Als nächstes entfernen Sie den Deckelschlupf und bedecken Sie die Embryonen mit Halocarbonöl, um eine weitere Austrocknung zu verhindern, während gleichzeitig Sauerstoff in die Embryonen diffundieren kann.

Um die Mikroinjektion durchzuführen, verwenden Sie ein Mikroinjektionssystem auf einem kompatiblen Mikroskop. Durch den Blick durch die Augenstücke, identifizieren Sie sowohl die Embryonen als auch die mit Injektionslösung vorbelastete Nadel. Brechen Sie die Nadel auf und stellen Sie sicher, dass sie konsistente und entsprechend große Flüssigkeitstropfen produziert. Bringen Sie dann die Nadel in den Embryo und injizieren Sie das entsprechende Volumen. Bringen Sie die Nadel heraus und fahren Sie mit der nächsten fort, die Injektion für die verbleibenden Embryonen zu wiederholen.

Im Beispielprotokoll wird eine Demonstration der Drosophila Embryo-Mikroinjektion für Live-Bildgebungsstudien zur Zellteilung zu sehen sein.

- Vor dem Aufstellen des Deckels, machen Heptankleber durch Ausrollen Doppelklebeband, und legen Sie es in eine 100 Milliliter Flasche. Fügen Sie etwa 50 Milliliter Heptan, versiegeln Sie die Flasche, und rocken Sie es für mehrere Tage.

Vor der Vorbereitung der Embryonen, machen Sie eine Dehydrierungskammer, in die die Embryonen vor der Injektion gelegt werden. Um dies zu tun, legen Sie einen Teil einer 35-Millimeter-Schale in eine 100-Millimeter-Petrischale, um einen "Tisch" zu machen. Fügen Sie Driedrit, das wasserfreies Calciumsulfat, um sie herum, so dass die Höhe des Drieritist ist nicht höher als die "Tabelle", und decken.

Um mit der Vorbereitung der Embryonen zu beginnen, sammeln Sie sie zunächst aus dem Laienkäfig, indem Sie die Traubensaftplatte stündlich mit Hefe wechseln. Die Embryonen sollten etwa zwei Stunden nach Beginn der Sammlung abgebildet werden. Um den Coverslip vorzubereiten, legen Sie ihn auf eine Seite eines Mikroskopschlittens und kleben Sie die vier Ecken nach unten, damit er sich nicht bewegt.

Mit einem Baumwoll-Applikator, legen Sie eine Schicht Heptankleber in eine Linie auf dem Deckel. Der Kleber sollte nicht zähflüssig und sollte in ein paar Sekunden trocknen. Wenn es zu dick ist, fügen Sie mehr Heptan.

Zum Schluss ein Stück Doppelklebeband auf die Rutsche neben dem Deckelschlupf legen. Mit einer befeuchteten Bürste die Embryonen vorsichtig von der Traubensaftplatte aufnehmen und auf das Doppelklebeband auf die Rutsche legen.

Als nächstes verwenden Sie eine Hälfte einer Pinzette, um die Embryonen über das Doppelklebeband zu rollen, bis die Chorion aufbricht. Nehmen Sie den Embryo auf, indem Sie ihn sanft über den Chorion rollen, so dass er an der Pinzette klebt, und legen Sie ihn auf den Heptankleber auf den Deckel, wobei die lange Seite des Embryos parallel zur langen Seite des Coverslips ist.

10 bis 20 Embryonen in einer Reihe platzieren. Den Deckelschlupf entfernen und drei bis acht Minuten in die Austrocknungskammer legen. Die Zeit hängt von der lokalen Luftfeuchtigkeit und der zu injizierenden Menge ab. Als nächstes legen Sie den Deckelschlupf mit Vakuumfett auf eine Metallkammer. Bedecken Sie die Embryonen schließlich mit Halocarbonöl, um weitere Austrocknung zu vermeiden.

Zuerst finden Sie die Embryonen unter einem 16-fachen Objektiv. Bewegen Sie die Embryonen weg, und finden Sie die Nadel, ohne die Brennebene zu bewegen. Zentrieren Sie die Nadel und bewegen Sie sie nach oben, ohne sie in X- oder Y-Richtung zu bewegen.

Um die Nadel zu öffnen, legen Sie die Kante des Deckelsinrutschen in das Sichtfeld, aber nicht, wo eine Nadel sein wird, und senken Sie die Nadel auf die gleiche Brennebene. Sehr vorsichtig, bewegen Sie den Coverslip, bis er die Nadel trifft und sanft bricht. Bewegen Sie die Nadel nach oben.

Nun bringen Sie die Embryonen ins Blickfeld. Senken Sie die Nadel in das Öl, und stellen Sie sicher, dass Sie schöne flüssige Tropfen aus der Nadel erhalten. Bewegen Sie den Embryo fest in die Nadel, injizieren Sie einen Tropfen in den Embryo und bewegen Sie den Embryo dann weg. Nachdem alle Embryonen injiziert wurden, sind sie bereit für die Beobachtung auf einem konfokalen Mikroskop mit einem 60- oder 100-Fach-Objektiv.