Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- Verwijder om te beginnen het hoofd van een verdoofde volwassen vlieg. Bedek de onthoofde vlieg met een oplossing met Fosfaatgebufferde Zoutoplossing, of PBS, en Bovine Serum Albumin, of BSA, om uitdroging te voorkomen. Houd de vlieg bij de thorax met een tang en trek vervolgens de buik met een tweede paar tangen om de darm bloot te leggen. Omdat het gewas, of de voedselopslagzak, aan de thorax wordt bevestigd, trekt u de darm voorzichtig weg.
Eenmaal losgemaakt, trekt u het gewas weg van de buik om de darm te ontvouwen. Trek het achterste uiteinde van de vlieg eraf om te beginnen met het bevrijden van de darm uit de buikholte. Blijf de darm trekken om het hele weefsel uit de buik te trekken. Eenmaal bevrijd, verwijdert u de foregut, Malpighiaanse tubuli, hindgut en eierstokken om alleen de ontlede midgut achter te laten, de primaire plaats van spijsvertering in de vlieg.
In het voorbeeldprotocol zullen we midguts van jonge en oude volwassen vliegen ontleden om verder te worden geanalyseerd via Fluorescentie-geactiveerde celsortering of FACS.
- Voordat u met de dissectie begint, verdooft u een flacon van 40 vliegen met kooldioxide op een standaard vliegbed. Gebruik vervolgens een scheermesje om alle vliegen te onthoofden en breng ze over in een dissectieschaal bedekt met agarosegel. Giet voldoende koude PBS plus BSA in de schaal om de agarose te bedekken. De vliegen zullen drijven.
Pak vervolgens voor elk insect op zijn beurt een vliegenbuik met een tang en de thorax met een andere. Scheid de thorax van de buik. De darm zal zichtbaar zijn en het gewas zal hoogstwaarschijnlijk nog steeds verbonden zijn met de thorax. Pak de darm en trek deze uit de thorax. Pak vervolgens het gewas en trek de darm iets voorin de buik weg om het uit te vouwen.
Gebruik vervolgens een van de tangen om het achterste uiteinde van de buik te grijpen, en de andere om de rand van de voorste open nagelriem vast te pakken. Trek het achterste uiteinde weg om de nagelriem te breken en blijf achterste voorzichtig trekken, totdat de hele darm uit de buikholte is getrokken. Verwijder de foregut, Malinese buizen, hindgut en eierstokken, waardoor de kale midgut achterblijft.
Als de midguts zijn geïsoleerd, gebruik dan een glazen Pasteur pipet om periodiek verschillende darmweefsels tegelijk over te brengen naar een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter met koude PBS plus BSA op ijs.
