Voorbereiding van Drosophila Heart: een techniek om hartfysiologie in de volwassen vlieg te bestuderen

- Anders dan bij gewervelde dieren maakt het Drosophila-hart deel uit van een open bloedsomloop. Het hart van een volwassen vlieg is een buisachtige structuur gebouwd van cardiomyocyten die door alaire spieren met de epidermis is verbonden en is ingebed in een extracellulaire matrix. De hartkamer bevindt zich aan het achterste uiteinde van de vlieg en pompt hemolymph in de aorta van waaruit het in de open lichaamsholte stroomt.

Bij insecten dient de hemolymfe als zowel bloed als interstitiële vloeistof, die voedingsstoffen, signaalmoleculen en immuuncellen vervoert. Andere oriëntatiepunten van het hart zijn ostia, die openingen langs de buis zijn, en intracardiale kleppen. Pericardiale cellen zijn gelokaliseerd langs de hartbuis en maken deel uit van het uitscheidingssysteem van de vlieg.

In een experimenteel hartpreparaat bootst de kunstmatige hemolymph fysiologische omstandigheden na om de weefselfunctie te behouden. Hoewel natuurlijke hemolymph niet verantwoordelijk is voor gasuitwisseling, moet de kunstmatige hemolymph goed zuurstofrijk zijn om het ontbreken van een functioneel luchtpijpsysteem te vervangen. In het volgende experiment demonstreren we een semi-intact hartpreparaat van een volwassen vlieg voor live beeldvorming of elektrofysiologie.

- Voordat we aan de slag gaan, bereiden we eerst een kunstmatige hemolymph-oplossing. Deze oplossing bevat sucrose en trehalose, die vlak voor gebruik aan de kunstmatige hemolymph moeten worden toegevoegd uit gekoelde voorraadoplossingen om bacteriële besmetting te voorkomen. Breng de kunstmatige hemolymph op kamertemperatuur en zuurstof de oplossing door minstens 15 minuten aan de lucht te borrelen.

Trek vervolgens verschillende fijne haarvaten met behulp van een standaard pipettrekker, die nodig is voor het verwijderen van dikke lichamen in de vlieg.

Zodra alles is voorbereid, moeten volwassen vliegen worden verdoofd. Dit kan worden gedaan met een korte blootstelling om twee tot vijf minuten dutje te doen, maar pas op dat de vliegen niet langer dan vijf minuten in het vliegdutje blijven. Kortdurende blootstelling aan kou kan ook worden gebruikt om vliegen te verdoven, maar kooldioxide wordt niet aanbevolen omdat het langdurige effecten heeft op de hartslag en ritmiek.

Vervolgens worden de verdoofde vliegen, dorsale kant naar beneden, in een Petrischaal geplaatst, bedekt met een dunne laag vaseline. De hydrofobe cutic in de vleugels en het lichaam moet omkeerbaar aan de gelei blijven plakken, maar de vlieg kan indien nodig worden verplaatst. Een eerste snede wordt gemaakt met een gebogen veerschaar. Dit wordt gedaan door de schaarbladen onder de poten van de vlieg te plaatsen en schuin naar beneden te buigen naar het dorsale oppervlak van de thorax in de buurt van de nek.

Het hoofd, het ventrale zenuwkoord en de benen worden verwijderd met een enkele snede. Eenmaal gesneden, wordt het preparaat vervolgens ondergedompeld in de zuurstofrijke kunstmatige hemolymph-oplossing. Met behulp van een veerschaar wordt de achterste punt van de buik, die bestaat uit buiksegment 7 en 8, verwijderd met een enkele snede. Dit biedt toegang voor het maken van laterale sneden langs beide randen van de buik en dient om de verbinding tussen de achterste darm en de buiksnoepelp te verbreken.

Steek de bladen van de schaar in de kleine opening in de punt van de buik en snijd de nagelriem lateraal. Dit maakt een rand van de ventrale cuticula vrij. Pak de flap vast met een tang en maak een vergelijkbare snede langs de tegenoverliggende laterale rand van de buik. De bevrijde flap van de ventrale buikschelpegel kan nu worden verwijderd.

De darmen en andere buikorganen kunnen meestal als een enkele massa worden verwijderd met behulp van juweliers tang en zacht trekken. Het verwijderen van de interne organen onthult de kloppende hartbuis, die nog steeds door kleine alaire spieren aan de dorsale cuticula is bevestigd en is omgeven door dikke lichamen. De getrokken haarvaten worden in plastic gestoken, 1/16-inch slang bevestigd aan een vacuümbron. De zuigkracht is evenredig met de tipdiameter, dus pipetten met uiteinden groter dan 40 micron.

Eenmaal opgezet, wordt dit zuigsysteem gebruikt om overtollig vet rond de hartbuis af te zuigen. Het kan ook worden gebruikt om luchtbellen te verwijderen die zich ophopen rond de nagelriem en eventuele vuil. Uiterste zorg moet worden genomen om te voorkomen dat het hart zelf wordt aangeraakt, en omdat het achterste deel van het hart erg kwetsbaar is, moet dat gebied helemaal worden vermeden. De volwassen Drosophila-hartbuis is nu blootgesteld en moet kloppen.

Indien nodig kunnen de cuticula en het aangehechte hart worden verplaatst door de nagelriem voorzichtig uit de vaseline te tillen en voorzichtig terug te temmen, waarbij opnieuw elk contact met het hartweefsel wordt vermeden. Op dit punt moet de oplossing die het preparaat baadt, worden vervangen door verse, kunstmatige hemolymph. Dit preparaat moet 20 tot 30 minuten met oxygenatie worden geïlibreerd voorafgaand aan manipulaties. Als het preparaat langer dan 60 minuten moet worden bewaard, moet het opnieuw worden toegediend. ook worden gebruikt voor elektrofysiologische registratie of voor histologische manipulaties.