Preparazione del cuore di Drosophila: una tecnica per studiare la fisiologia cardiaca nella mosca adulta

- Diverso dai vertebrati, il cuore di Drosophila fa parte di un sistema circolatorio aperto. Il cuore di una mosca adulta è una struttura simile a un tubo costruita da cardiomiociti collegata all'epidermide da muscoli alari e incorporata nella matrice extracellulare. La camera cardiaca si trova all'estremità posteriore della mosca e pompa l'emolinfa nell'aorta da cui scorre nella cavità del corpo aperto.

Negli insetti, l'emolinfa funge sia da sangue che da liquido interstiziale, trasportando nutrienti, molecole di segnalazione e cellule immunitarie. Ulteriori punti di riferimento del cuore includono ostia, che si aprono lungo il tubo, e valvole intracardiache. Le cellule pericardiche sono localizzate lungo il tubo cardiaco e fanno parte del sistema escretore della mosca.

In una preparazione sperimentale del cuore, l'emolinfa artificiale imita le condizioni fisiologiche per preservare la funzione tissutale. Sebbene l'emolinfa naturale non sia responsabile dello scambio di gas, l'emolinfa artificiale deve essere ben ossigenata per sostituire la mancanza di un sistema tracheale funzionale. Nell'esperimento seguente dimostriamo una preparazione cardiaca semi-intatta da una mosca adulta per l'imaging vivo o l'elettrofisiologia.

- Prima di iniziare, prepariamo prima una soluzione di emolinfa artificiale. Questa soluzione contiene saccarosio e trealosio, che devono essere aggiunti all'emolinfa artificiale da soluzioni di scorte refrigerate poco prima dell'uso per prevenire la contaminazione batterica. Portare l'emolinfa artificiale a temperatura ambiente e ossigenare la soluzione gorgogliando d'aria per almeno 15 minuti.

Successivamente, tirare diversi capillari fini utilizzando un estrattore di pipetta standard, che sarà necessario per la rimozione dei corpi grassi nella mosca.

Una volta che tutto è stato preparato, le mosche adulte devono essere anestetizzate. Questo può essere fatto usando una breve esposizione al pisolino a mosca per due o cinque minuti, ma fare attenzione a non lasciare le mosche nel pisolino a mosca più di cinque minuti. L'esposizione a breve termine al freddo può anche essere utilizzata per anestetizzare le mosche, ma l'anidride carbonica non è raccomandata poiché ha effetti più duraturi sulla frequenza cardiaca e sulla ritmicità.

Successivamente, le mosche anestetizzate vengono posizionate, lato dorsale verso il basso, in una piastra di Petri rivestita con un sottile strato di vaselina. La cuticola idrofobica nelle ali e nel corpo dovrebbe invertirsi alla gelatina, ma la mosca può essere riposizionata se necessario. Un taglio iniziale viene effettuato utilizzando un paio curvo di forbici a molla. Questo viene fatto posizionando le forbici sotto le gambe della mosca e inclinate verso la superficie dorsale del torace vicino al collo.

La testa, il cordone nervoso ventrale e le gambe vengono rimossi con un solo taglio. Una volta tagliato, la preparazione viene quindi immersa nella soluzione emolinfa artificiale ossigenata. Utilizzando le forbici a molla, la punta posteriore dell'addome, costituita dal segmento addominale 7 e 8, viene rimossa con un solo taglio. Ciò consente di effettuare tagli laterali lungo entrambi i bordi dell'addome e serve a tagliare la connessione tra l'intestino posteriore e la cuticola addominale.

Inserire le lame delle forbici nella piccola apertura nella punta dell'addome e tagliare lateralmente la cuticola. Questo libera un bordo della cuticola ventrale. Afferrare il lembo con le alette e fare un taglio simile lungo il bordo laterale opposto delladdome. Il lembo liberato della cuticola addominale ventrale può ora essere rimosso.

L'intestino e altri organi addominali possono di solito essere rimossi come una singola massa usando forcep gioiellieri e tiri delicati. La rimozione degli organi interni rivela il tubo cardiaco pulsante, che è ancora attaccato alla cuticola dorsale da piccoli muscoli alari ed è circondato da corpi grassi. I capillari tirati vengono inseriti in plastica, tubi da 1/16 pollici attaccati a una fonte di vuoto. La forza di aspirazione è proporzionale al diametro della punta, quindi non devono essere utilizzate pipette con punte di diametro superiore a 40 micron.

Una volta impostato, questo sistema di aspirazione viene utilizzato per espirare il grasso in eccesso da tutto il tubo cardiaco. Può essere utilizzato anche per rimuovere le bolle d'aria che si accumulano intorno alla cuticola e a eventuali detriti. Occorre prestare estrema attenzione per evitare di toccare il cuore stesso e, poiché la porzione posteriore del cuore è molto fragile, tale regione dovrebbe essere evitata del tutto. Il tubo cardiaco adulto Drosophila è ora esposto e dovrebbe essere battuto.

Se necessario, la cuticola e il cuore attaccato possono essere riposizionati sollevando delicatamente la cuticola dalla vaselina e domarla con cura verso il basso, evitando nuovamente qualsiasi contatto con il tessuto cardiaco. A questo punto, la soluzione che bagna la preparazione deve essere sostituita con un'emolinfa fresca e artificiale. Questa preparazione deve essere consentita per equilibrare per 20-30 minuti con ossigenazione prima di eventuali manipolazioni. Se la preparazione deve essere mantenuta per più di 60 minuti, deve essere ri-perfusa con emolinfa artificiale fresca. Questa preparazione è ora pronta per essere utilizzata per la registrazione ottica e può essere essere utilizzato anche per la registrazione elettrofisiologica o per manipolazioni istologiche.