Drosophila Kalbinin Hazırlanması: Yetişkin Sineği'nde Kalp Fizyolojisini İnceleme Tekniği

- Omurgalılardan farklı drosophila kalbi açık dolaşım sisteminin bir parçasıdır.. Yetişkin bir sineğin kalbi, alary kasları tarafından epidermisin içine bağlanan ve hücre dışı matrise gömülü kardiyomiyositlerden inşa edilmiş tüp benzeri bir yapıdır. Kalp odası, sineğin arka ucundadır ve açık vücut boşluğuna aktığı aorta hemolimf pompalar.

Böceklerde, hemolimf hem kan hem de interstisyel sıvı, besinleri, sinyal moleküllerini ve bağışıklık hücrelerini taşır. Kalbin ek simge yapıları arasında tüp boyunca açıklıklar olan ostia ve intrakardiyak kapaklar bulunur. Perikardiyal hücreler kalp tüpü boyunca lokalizedir ve sineğin boşaltım sisteminin bir parçasıdır.

Deneysel bir kalp hazırlığında, yapay hemolimf doku fonksiyonunu korumak için fizyolojik koşulları taklit eder. Doğal hemolimf gaz değişiminden sorumlu olmasa da, fonksiyonel trakeal sistemin eksikliğinin yerine geçmek için yapay hemolimf iyi oksijenlenmelidir. Sonraki deneyde, canlı görüntüleme veya elektrofizyoloji için yetişkin bir sinekten yarı bozulmamış bir kalp hazırlığı gösteriyoruz.

- Başlamadan önce, önce bir suni hemolimf çözeltisi hazırlıyoruz. Bu çözelti, bakteriyel kirlenmeyi önlemek için kullanımdan hemen önce soğutmalı stok çözeltilerinden suni hemolimf eklenmesi gereken sakkaroz ve trehaloz içerir. Suni hemolimfi oda sıcaklığına getirin ve çözeltiyi en az 15 dakika hava köpürterek oksijenlendirin.

Daha sonra, sinekteki yağ kütlelerinin çıkarılması için gerekli olacak standart bir pipet çekeceği kullanarak birkaç ince kılcal damar çekin.

Her şey hazırlandıktan sonra, yetişkin sinekler uyuşturulmalıdır. Bu, iki ila beş dakika boyunca sinek uykusunda uçmak için kısa bir maruziyet kullanılarak yapılabilir, ancak sinekleri beş dakikadan daha uzun süre sinek uykusunda bırakmamaya dikkat edin. Soğuk algınlığına kısa süreli maruz kalma, sinekleri uyuşturmak için de kullanılabilir, ancak kalp atış hızı ve ritmiklik üzerinde daha uzun süreli etkileri olduğu için karbondioksit önerilmez.

Daha sonra, uyuşturulma sinekleri yerleştirilir, dorsal tarafı aşağı, ince bir petrol jöle tabakası ile kaplanmış bir Petri kabına. Kanatlardaki ve vücuttaki hidrofobik kütikül geri dönüşümlü olarak jöleye yapışmalıdır, ancak gerekirse sinek yeniden konumlandırılabilir. Kavisli bir yay makası kullanılarak ilk kesim yapılır. Bu, makas bıçaklarının sineğin bacaklarının altına yerleştirilmesi ve boynun yakınındaki toraksın dorsal yüzeyine doğru açılı olmasıyla yapılır.

Baş, ventral sinir kordonu ve bacaklar tek bir kesikle çıkarılır. Kesildikten sonra, preparat oksijenli yapay hemolimf çözeltisine batırılır. Yay makası kullanılarak, karın segmenti 7 ve 8'den oluşan karın arka ucu tek bir kesikle çıkarılır. Bu, karnın her iki kenarı boyunca yanal kesikler yapmak için erişim sağlar ve arka oluk ile karın çatalı arasındaki bağlantıyı kesmeye yarar.

Makasın bıçaklarını karın ucundaki küçük açıklığa yerleştirin ve kütikülleri yanal olarak kesin. Bu, ventral kütikülün bir kenarını boşaltır. Kapağı önps ile kavrayın ve karnın karşı lateral kenarı boyunca benzer bir kesim yapın. Ventral karın kütiküllerinin serbest kapağı artık çıkarılabilir.

Bağırsak ve diğer karın organları genellikle kuyumcular tıslama ve hafif çekme kullanılarak tek bir kütle olarak çıkarılabilir. İç organların çıkarılması, hala küçük alary kasları tarafından dorsal kütiküle bağlı olan ve yağ kütleleri ile çevrili olan atan kalp tüpünü ortaya çıkarır. Çekilen kılcal damarlar plastiğe yerleştirilir, vakum kaynağına bağlı 1/16 inç tüp. Emme kuvveti uç çapı ile orantılıdır, bu nedenle çapı 40 mikrondan büyük uçlu pipetler kullanılmamalıdır.

Kurulduktan sonra, bu emme sistemi kalp tüpünün etrafındaki fazla yağı emmek için kullanılır. Kütikül ve herhangi bir döküntü etrafında biriken hava kabarcıklarını gidermek için de kullanılabilir. Kalbin kendisine dokunmamak için aşırı özen gösterilmeli ve kalbin arka kısmı çok kırılgan olduğu için, o bölgeden tamamen kaçınılmalıdır. Yetişkin Drosophila kalp tüpü artık maruz kalır ve atmalıdır.

Gerekirse, kütikül ve bağlı kalp, kütikül petrol jölesinin içinden hafifçe kaldırılarak ve dikkatlice geri evcilleştirilerek yeniden konumlandırılabilir ve yine kalp dokusuyla herhangi bir temastan kaçınılabilir. Bu noktada, preparatı yıkayan çözelti taze, yapay hemolimf ile değiştirilmelidir. Bu preparatın herhangi bir manipülasyondan önce oksijenlenme ile 20 ila 30 dakika boyunca dengelenmesine izin verilmelidir. Hazırlık 60 dakikadan uzun süre korunacaksa, taze yapay hemolimf ile yeniden perfüzyon yapılmalıdır. Bu preparat artık optik kayıt için kullanılmaya hazırdır ve kullanılabilir. elektrofizyolojik kayıt veya histolojik manipülasyonlar için de kullanılır.