Encyclopedia of Experiments: Biology
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- Comece preparando o composto a ser testado para a toxicidade, e distribua-o para os poços de uma placa de ensaio. Transfira os vermes do estágio de desenvolvimento apropriado para cada poço, e inicie imediatamente um temporizador. Observe todos os vermes que estão danificados e não os incluam em seus cálculos de sobrevivência.
Após um tempo predeterminado, conte o número de vermes que ainda estão vivos em cada poço. A luz brilhante de um microscópio de dissecção ou toques suaves na placa deve fazer com que quaisquer vermes vivos se movam. Repita essa observação após cada intervalo de tempo, até que a maioria dos animais esteja morta. No protocolo seguinte, observaremos o tempo de sobrevivência das larvas L4 durante a exposição ao paraquat, um composto que induz o estresse oxidativo.
- Nesta demonstração, o estresse oxidativo será induzido por meio de paraquat. Prepare uma nova solução de aquat de 100 milialares, conforme descrito no texto do protocolo de acompanhamento. Paraquat é um composto perigoso e altamente tóxico, e deve ser tratado de acordo com as diretrizes adequadas.
Pipeta 40 microliters da solução paraquat para cada poço de uma placa de 96 poços. Use pelo menos 12 poços como réplicas de cada condição testada. Usando uma picareta de verme de fio de platina, transfira de cinco a oito animais larvas L4 para cada poço.
Indique o tempo de início e o tempo final para cada condição testada. Coloque a placa de 96 poços a 20 graus Celsius. Uma hora após o horário de início, marque animais vivos e mortos usando um microscópio dissecando.
Vermes que não se movem mesmo depois de detectar uma luz de alta intensidade são marcados como mortos. Olhe para a forma de vermes, caudas e movimento da cabeça em alta ampliação para distinguir vermes mortos de vermes vivos. Marcar sobrevivência a cada hora até que a maioria dos vermes esteja morta, e repita este ensaio pelo menos três vezes independentes.
Para determinar a porcentagem de sobrevivência para cada ponto de tempo, primeiro calcule o número total de animais por condição adicionando o número total de animais transferidos para cada poço. Ignore os animais que foram danificados ou mortos após a transferência. Em seguida, para cada ponto de tempo, calcule o número total de animais mortos por condição. Calcule a porcentagem de óbito e a porcentagem de sobrevivência.
