Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- Start med pelleterede æg, der blev isoleret ved blegning gravid voksen orme. Sørg for hvert trin i denne procedure udføres sterilt for at undgå forurening af de dyrkede celler. Suspendere pellet i en opløsning af chitinase, et enzym, der nedbryder chitin - et stort polysaccharid, der er en strukturel del af æggeskallen.
Efter en passende fordøjelsesperiode centrifugeres æggene forsigtigt og erstatter supernatanten med cellekulturmedie for at stoppe fordøjelsen. Derefter passerer embryonerne gennem en 18-gauge nål til mekanisk at adskille individuelle celler. Næste, filtrere opløsningen for at fjerne snavs fra æggeskallen eller uadskillelige celle klumper. Plate cellerne i en kultur parabol på et glas dække slip belagt med peanut agglutinin - en lectin, der hjælper cellerne til at knytte til dækslet glide ved bindende celle overflade kulhydrater.
I eksempelprotokollen vil vi forberede embryonale celler til in vitro morfologisk differentiering og analyse.
- Mens du arbejder under en laminar flow hætte for at undgå at indføre bakteriel forurening, genindførte pelleterede æg i en milliliter på to milligram pr. milliliter chitinase og overføre dem til en frisk 15 milliliter konisk rør. Rock røret i 10 til 30 minutter ved stuetemperatur, afhængigt af friskhed af enzymet. Når ca 80% af æggeskallerne fordøjes, centrifuge æggene på 900 g i tre minutter.
Efter omhyggelig fjernelse af supernatanten tilsættes tre milliliter L15-medium. Overfør æggene til en seks centimeter diameterplade og begynd manuel dissociation ved hjælp af en 10-milliliter steril sprøjte med en 18-gauge nål. For at overvåge graden af dissociation skal du placere en dråbe suspension i en frisk petriskål og se under et mikroskop. Fortsæt indtil ca. 80% af cellerne er dissoberet.
For at fjerne celleklumper, ufordøjede æg, og udklækkede larver filtrerer forsigtigt suspensionen gennem et fem-mikron filter og kører yderligere fire til fem milliliter L15-medium gennem filteret for at genvinde cellerne.
