Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- Begin met geplet eieren die werden geïsoleerd door het bleken van gravid volwassen wormen. Zorg ervoor dat elke stap van deze procedure steriel wordt uitgevoerd om besmetting van de gekweekte cellen te voorkomen. Hang de pellet op in een oplossing van chitinase, een enzym dat chitine afbreekt- een groot polysacharide dat een structureel onderdeel van de eierschaal is.
Na een geschikte verteringsperiode, centrifugeer de eieren voorzichtig en vervang het supernatant door celkweekmedium om de spijsvertering te stoppen. Geef vervolgens de embryo's door een 18-gauge naald om individuele cellen mechanisch te scheiden. Filter vervolgens de oplossing om vuil uit de eierschaal of onafscheidelijke celklonters te verwijderen. Leg de cellen in een kweekschaal op een glazen deksel met pindaagglutinine- een lectine die de cellen helpt zich aan de afdekking te hechten door cel te binden.
In het voorbeeldprotocol bereiden we embryonale cellen voor op in vitro morfologische differentiatie en analyse.
- Tijdens het werken onder een laminaire stroomkap om bacteriële besmetting te voorkomen, resuspendeer de gepelde eieren in één milliliter van twee milligram per milliliter chitinase en breng ze over in een verse conische buis van 15 milliliter. Schommel de buis gedurende 10 tot 30 minuten op kamertemperatuur, afhankelijk van de versheid van het enzym. Wanneer ongeveer 80% van de eierschalen wordt verteerd, centrifugeer de eieren op 900 g gedurende drie minuten.
Nadat u het supernatant zorgvuldig hebt verwijderd, voegt u drie milliliter L15-medium toe. Breng de eieren over in een plaat met een diameter van zes centimeter en begin met handmatige dissociatie met een steriele spuit van 10 milliliter met een naald van 18 gauge. Om de mate van dissociatie te controleren, plaatst u een druppel suspensie in een verse Petrischaal en bekijkt u onder een microscoop. Ga door totdat ongeveer 80% van de cellen is gedissocieerd.
Om celklonters, onverteerde eieren en uitgebroede larven te verwijderen, filtert u de suspensie voorzichtig door een filter van vijf micron en voert u nog eens vier tot vijf milliliter L15-medium door het filter om de cellen terug te winnen. Om de cellen na het centrifugeren van het filtraat gedurende drie minuten op 900 g te laten groeien, hangt u de cellen opnieuw op in het volledige L15-medium.
