Encyclopedia of Experiments: Biology
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- Iniziare con le uova pelletate isolate sbiancando i vermi adulti gravidi. Assicurarsi che ogni fase di questa procedura sia condotta sterilemente per evitare la contaminazione delle cellule coltivate. Sospendere il pellet in una soluzione di chitinasi, un enzima che scompone la chitina, un grande polisaccaride che è un componente strutturale del guscio d'uovo.
Dopo un adeguato periodo di digestione, Centrifugare delicatamente le uova e sostituire il supernatante con un mezzo di coltura cellulare per interrompere la digestione. Quindi, passare gli embrioni attraverso un ago calibro 18 per separare meccanicamente le singole cellule. Successivamente, filtrare la soluzione per rimuovere i detriti dal guscio dell'uovo o grumi cellulari non separati. Placcare le cellule in un piatto di coltura su una copertura di vetro ricoperta di arachidi agglutinina, una letta che aiuta le cellule ad attaccarsi allo scivolamento della copertura legando i carboidrati della superficie cellulare.
Nel protocollo di esempio prepareremo cellule embrionali per la differenziazione e l'analisi morfologica in vitro.
- Durante il lavoro sotto una cappa di flusso laminare per evitare l'introduzione di contaminazione batterica, rimescolare le uova pelletate in un millilitro di due milligrammi per millilitro chitinasi e trasferirle in un tubo conico fresco da 15 millilitri. Dondolare il tubo per 10-30 minuti a temperatura ambiente, a seconda della freschezza dell'enzima. Quando circa l'80% dei gusci d'uovo viene digerito, centrifugare le uova a 900 g per tre minuti.
Dopo aver rimosso con cura il supernatante, aggiungere tre millilitri di mezzo L15. Trasferire le uova in una piastra di diametro di sei centimetri e iniziare la dissociazione manuale utilizzando una siringa sterile da 10 millilitri con un ago calibro 18. Per monitorare il grado di dissociazione, posizionare una goccia di sospensione in una piastra di Petri fresca e visualizzare al microscopio. Continuare fino a quando circa l'80% delle cellule non viene dissociato.
Per rimuovere ciuffi cellulari, uova non digerite, e le larve tratteggiate, filtrare delicatamente la sospensione attraverso un filtro da cinque micron ed eseguire altri quattro o cinque millilitri di mezzo L15 attraverso il filtro per recuperare le cellule. Per colturare le cellule dopo aver centrifugato il filtrato a 900 g per tre minuti, sospendere le cellule in mezzo L15 completo. Placcare un millilitro per pozzo e conservare le piastre in una camera sigillata umida a 20 gradi Celsius nell'aria ambiente.
