Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- Начните с гранулированного яйца, которые были выделены путем отбеливания gravid взрослых червей. Убедитесь, что каждый шаг этой процедуры проводится стерильно, чтобы избежать загрязнения культурных клеток. Приостановить гранулы в растворе хитиназы, фермент, который расщепляет хитин - большой полисахарид, который является структурным компонентом яичной скорлупы.
После соответствующего периода пищеварения, аккуратно центрифуга яйца и заменить supernatant с клеточной культуры среды, чтобы остановить пищеварение.Затем, пройти эмбрионов через 18-го калибра иглы механически отделить отдельные клетки. Далее, фильтровать раствор для удаления мусора из яичной скорлупы или неотделенных клеток clumps. Плита клеток в культуре блюдо на стеклянной крышке скольжения покрыты арахисом agglutinin - лектин, который помогает клетки прикрепляются к клетке.
В примере протокола мы подготовим эмбриональные клетки для морфологической дифференциации и анализа in vitro.
- Во время работы под капотом ламинарного потока, чтобы избежать введения бактериального загрязнения, повторно помыть гранулированные яйца в один миллилитр из двух миллиграммов на миллилитр хитиназы и передать их в свежие 15 миллилитров конической трубки. Рок трубки в течение 10 до 30 минут при комнатной температуре, в зависимости от свежести фермента. Когда примерно 80% яичной скорлупы перевариваются, центрифуга яйца при 900 г в течение трех минут.
После тщательного удаления супернатанта добавьте три миллилитров L15 medium. Перенесите яйца в пластину диаметром шесть сантиметров и начните ручную диссоциацию с помощью 10-миллилитрового стерильного шприца с 18-калиберной иглой. Для контроля степени диссоциации поместите каплю суспензии в свежую чашку Петри и посмотрите под микроскопом.
Чтобы удалить скопления клеток, непереваренные яйца, и вылупившихся личинок, осторожно фильтровать подвеску через фильтр пять микронов и запустить дополнительные четыре-пять миллилитров L15 среды через фильтр для восстановления клеток. Для культуры клеток после центрифугирования фильтра на 900 г в течение трех минут, повторно приостановить клетки в полном L15 среды. Плита один миллилитр на колодец, и хранить пластины во влажной герметичной камере на 20 градусов по Цельсию.
