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Encyclopedia of Experiments: Biology

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Digestión enzimática y disociación manual

 
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Digestión enzimática y disociación manual: un método para preparar embriones C. elegans para el cultivo celular

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- Comenzar con huevos peletizados que fueron aislados por el blanqueamiento de gusanos adultos gravid. Asegúrese de que cada paso de este procedimiento se lleva a cabo estérilmente para evitar la contaminación de las células cultivadas. Suspender el pellet en una solución de quitasa, una enzima que descompone la quitina - un polisacárido grande que es un componente estructural de la cáscara de huevo.

Después de un período de digestión apropiado, Centrífuga suavemente los huevos y reemplace el sobrenadante por un medio de cultivo celular para detener la digestión.

En el protocolo de ejemplo, prepararemos células embrionarias para la diferenciación y análisis morfológico in vitro.

- Mientras se trabaja bajo una campana de flujo laminar para evitar la introducción de contaminación bacteriana, resuspend los huevos peletizados en un mililitro de dos miligramos por mililitro cintinasa y transferirlos a un tubo cónico fresco de 15 mililitros. Mezcle el tubo durante 10 a 30 minutos a temperatura ambiente, dependiendo de la frescura de la enzima.

Después de retirar cuidadosamente el sobrenadante, agregue tres mililitros de L15 medio. Transfiera los huevos a una placa de seis centímetros de diámetro y comience la disociación manual usando una jeringa estéril de 10 mililitros con una aguja del calibre 18.

Para eliminar grumos celulares, huevos sin digerir, y las larvas eclosionadas, filtran suavemente la suspensión a través de un filtro de cinco micras y ejecutan entre cuatro y cinco mililitros adicionales de medio L15 a través del filtro para recuperar las células.

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