Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- Börja med pelleterade ägg som isolerades genom blekning av gravida vuxna maskar. Se till att varje steg i detta förfarande utförs sterilt för att undvika förorening av de odlade cellerna.
Efter en lämplig matsmältningsperiod, centrifugera försiktigt äggen och ersätt supernatanten med cellkulturmedium för att stoppa matsmältningen. Skicka sedan embryona genom en 18-gauge nål för att mekaniskt separera enskilda celler. Därefter filtrera lösningen för att ta bort skräp från äggskalet eller oskiljaktiga cellklumpar.
I exempelprotokollet kommer vi att förbereda embryonala celler för in vitro-morfologisk differentiering och analys.
- Medan du arbetar under en laminär flödeshuv för att undvika att införa bakteriell kontaminering, återanvänd de pelleterade äggen i en milliliter två milligram per milliliter chitinas och överför dem till ett friskt koniskt rör på 15 milliliter.
Efter att noggrant ha tagit bort supernatanten, tillsätt tre milliliter L15 medium. Överför äggen till en sex centimeter diameterplatta och börja manuell dissociation med en 10 milliliter steril spruta med en 18-gauge nål. För att övervaka graden av dissociation, placera en droppe suspension i en färsk Petri-skål och se under ett mikroskop.
Så här tar du bort cellklumpar osmälta ägg och kläckta larver filtrerar försiktigt suspensionen genom ett femmikronfilter och kör ytterligare fyra till fem milliliter L15-medium genom filtret för att återställa cellerna.
