Enzymatic Sindirim ve Manuel Ayrışma: C. elegans Embriyolarını Hücre Kültürüne Hazırlama Yöntemi

- Gravid yetişkin solucanlarının ağartılmasıyla izole edilen peletlenmiş yumurtalarla başlayın. Kültürlü hücrelerin kirlenmesini önlemek için bu prosedürün her adımının steril bir şekilde yürütüldüğünden emin olun. Peleti, yumurta kabuğunun yapısal bir bileşeni olan büyük bir polisakkarit olan kitini parçalayan bir enzim olan kitine çözeltisinde askıya alın.

Uygun bir sindirim döneminden sonra, yumurtaları hafifçe santrifüj edin ve sindirimi durdurmak için süpernatantı hücre kültürü ortamı ile değiştirin. Daha sonra, embriyoları tek tek hücreleri mekanik olarak ayırmak için 18 kalibrelik bir iğneden geçirin.

Örnek protokolde embriyonik hücreleri in vitro morfolojik farklılaşma ve analiz için hazırlayacağız.

- Bakteriyel kontaminasyonu önlemek için laminer akış başlığı altında çalışırken, peletlenmiş yumurtaları mililitre başına iki miligramlık bir mililitrede yeniden depolayın ve taze 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Enzimin tazeliğine bağlı olarak tüpü oda sıcaklığında 10 ila 30 dakika sallayın. Yumurta kabuklarının yaklaşık% 80'i sindirildiğinde, yumurtaları üç dakika boyunca 900 g'da santrifüjleyin.

Süpernatant dikkatlice çıkardıktan sonra, üç mililitre L15 ortamı ekleyin. Yumurtaları altı santimetre çapında bir plakaya aktarın ve 18 kalibrelik bir iğne ile 10 mililitrelik steril bir şırınga kullanarak manuel ayrışmaya başlayın. Ayrışma derecesini izlemek için, bir damla süspansiyonu taze bir Petri kabına yerleştirin ve mikroskop altında görüntüleyin. Hücrelerin yaklaşık% 80'i çözülene kadar devam edin.

Hücre kümelerini, sindirilmemiş yumurtaları ve yumurtadan çıkmış larvaları çıkarmak için, süspansiyonu beş mikronluk bir filtreden hafifçe filtreleyin ve hücreleri kurtarmak için filtreden dört ila beş mililitrelik ek bir L15 ortamı çalıştırın. Filtratı üç dakika boyunca 900 g'da santrifüjledikten sonra hücreleri kültürlemek için, hücreleri tam L15 ortamında yeniden askıya alın.