Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- For å forstå oppståtte forhold og reagere på dem deretter, har ormen C. elegans blant annet et høyt utviklet kjemosensorisk system som er i stand til å oppdage et bredt spekter av forskjellige kjemikalier.
Sensoriske nevroner i hodet, amphid og indre labiale nevroner, samt nevroner i halen, phasmid nevronene, er enten direkte eller indirekte utsatt gjennom kutikalen til ytre forhold. Disse kjemosensoriske nevronene koder relevant informasjon som brukes av ormen for å produsere en passende atferdsrespons: en oppførsel kalt kjemoakse.
For å teste den kjemosaktiske responsen på enten flyktige luktstoffer eller gustatory vannløselige signaler, isolere ormer av ønsket utviklingsstadium og utsette dem for testkjemikaliet på en tidligere forberedt eksperimentell arena. Når de blir utsatt for gunstige kjemikalier som de som produseres av en bakteriell matkilde, viser C. elegans positive chemotaxis mot kilden.
Omvendt, når den utsettes for mindre gunstige eller giftige kjemikalier som tungmetaller, viser ormen negative chemotaxis, unngår kjemikaliet. Derfor klarer ikke olfaktoriske eller gustatory mutanter å unngå aversive kjemikalier og forbli i ugunstige forhold i motsetning til ville type dyr som unngår den aversive tilstanden.
I eksempelprotokollen vil vi se en demonstrasjon av en chemotaxis-analyse, som tester ormens aversjon mot kobber.
- Etter inkubering over natten, fjern plater fra inkubatoren og bruk den markerte undersiden av platen som guide, pipette 100 mikroliter nylagde 0,5 molar kobber to sulfatløsning på kanten av agaren for å skape en ytre kobberbarriere. Pipette 25 mikroliter av kobberet to sulfatløsning for å skape en midtlinjebarriere.
Påse at kobberets tosulfatløsning ikke kommer i kontakt med bakterieplasteret, og la kobberoppløsningen tørke på platen. Kontroller tørrhet hvert femte minutt etter overføring med laboratorievev ved å lett dabbe løsningen nær kanten av platen for å skjelne.
Umiddelbart før analysen overfører du de eksperimentelle organismene til en bakteriefri agarplate og lar nematodene bevege seg fritt i ett minutt for å fjerne overflødige bakterier.
Deretter pipette 1 milliliter M9 på tallerkenen med unge voksne som ble overført 24 timer tidligere for å vaske ormer i et mikrocentrifugerør. Sentrifuger nematodene på 3000 ganger g i ett minutt.
Ormer skal danne en pellets på bunnen av røret. Aspirate M9-løsning uten å forstyrre ormepellet. Tilsett 1 milliliter M9-løsning til ormepellet. Inverter rør for å blande ormer med løsningen.
Hvis overflødige bakterier først ble overført med ormene, gjenta i totalt fem ganger. Etter den endelige vasken aspirerer du supernatanten til 100 mikroliter M9-løsning og ormepellets forblir. Overfør ormer umiddelbart fra løsningen når vasketrinnene er fullført.
Pipette 20 mikroliter av ormepellets fra bunnen av røret til den bakteriefrie halvdelen av analyseplaten. Sørg for at 10 ormer overføres til analyseplaten og at det ikke finnes forurensende mat. Ingen bakterier skal overføres til kobbermatløpsplatene.
Fjern overflødig M9-løsning fra nematodene med et laboratorievev innen ett minutt. Forsikre deg om at M9-løsningen ikke kommer i kontakt med kobberets to sulfatoppløsning, og at ormene og agaroverflaten forblir intakte. Kast ormer som ved et uhell er fjernet med laboratorievevet.
Når M9-løsningen er fjernet og alle ormer har påbegynt ikke-flytende lokomotoriske mønstre, det vil si når de har sluttet å banke, start analysestoppklokken. Hvis ekstra ormer ble inkludert ved et uhell, fjern dem ved å plukke med halokarbonolje for å sikre at ingen bakterier legges til platen.
Kontroller analyseplater hvert 30. For analyseplatene med bakterieplaster, skår organismer positivt hvis de nådde matplasteret over en fire timers periode. For de negative kontrollplatene, score organismer positivt hvis de har krysset barrieren.
