К. Элеганс Отслеживание движения: метод оценки передвижения червей

- Для оценки передвижения в C. elegans используйте камеру для записи движения червей на агар-пластине, обеспечивая даже освещение пластины во время записи.

Поместите несколько медных колец на одну пластину, чтобы одновременно отслеживать червей в каждом кольце. Это позволяет проводить оценку контроля и экспериментальных животных в одинаковых условиях, уменьшая изо дня в день изменчивость и позволяя параллельно сравнивать. Запись движения червей в течение установленных интервалов времени, и использовать компьютерное программное обеспечение для анализа особенностей поведения локомотива, таких как скорость движения и пройденное расстояние.

В примере протокола, мы увидим демонстрацию движения отслеживания анализа воздействия алкоголя на скорость передвижения червя.

- Для начала возьмите две минуты или меньше, чтобы перенести 10 червей из каждой экспериментальной группы в центр медного кольца на акклиматизационные пластины. Это тарелка без этанола. Избегайте передачи пищи с червями, так как это уменьшит их движение. Также избегайте повреждения поверхности агара, потому что черви будут норы. Запись времени погрузки на тарелку, и не забудьте пошатнуть передачу червей на каждую пластину более чем на две минуты, так что каждая пластина может быть снята в течение двух минут.

Пусть каждая акклиматизируемая пластина инкубируют при комнатной температуре в течение 30 минут. Затем перенесите червей на анализную пластину, следуя приказу, используемому для помещения червей на акклиматизационные пластины.

- Скорость, с которой животные передаются на этом этапе очень важно, потому что переданные животные будут подвергаться воздействию этанола дольше. Так что это хорошая идея, чтобы повернуть, какие штаммы помещаются на пластине сначала через экспериментальные репликации.

- Микроскоп с высоким разрешением видеокамеры требуется для пленки червей сейчас. Даже освещение, например, с трехдюймового квадратного подсветки, имеет жизненно важное значение для анализа.

Подготовь программное обеспечение для анализа изображений для захвата 120 кадров, 12-битных, серых, временных фильмов в одном кадре в секунду.

Теперь записывают двухминутные фильмы с каждой пластины, через 10 минут после того, как последние черви были помещены на тарелку. Затем сделайте вторую двухминутную запись, через 30 минут после того, как черви были помещены на тарелку. Для этой демонстрации используется программное обеспечение Image-Pro Plus, так как к технике можно адаптировать широкий спектр другого программного обеспечения.

Сначала примените фильтр к изображениям, которые выравнивают фон и усиливают контраст объектов червя. Под меню выберите процесс, затем фильтры, затем улучшение, а затем Flatten. Установите параметр для темного фона и ширины функции 20 Pix.

Теперь проанализируйте передвижение животных в каждом кольце отдельно с круговой областью интереса, которая перекрывает медное кольцо.

В окне таблицы отслеживания данных используйте кнопку "Параметры отслеживания", чтобы исключить определенные треки и ограничить любые экспериментальные артефакты. Под вкладкой Auto Tracking установите параметры трека до предела скорости 400 микрон на кадр.

Установите минимальную общую длину трека до 400 микрон, и установите преобладающий тип движения до хаотического. Затем под параметром трека установите объекты, чтобы позволить Частичным трекам иметь минимальную длину 21 кадр и иметь глубину проекции отслеживания одного кадра.

Теперь, чтобы инициировать процесс отслеживания, сначала нажмите кнопку функции Find All Tracks Automatically.Это поднимает диалоговое окно Count/Size Options и окно Tracking Dialog. Выберите опцию Руководства для выбора диапазона интенсивности в диалоговом поле Count/Size. Это обеспечивает важный пороговый шаг. Затем настраивает ползунки порога интенсивности, чтобы создать инклюзивный диапазон, который выделяет темные объекты.

Теперь примените фильтр размера, чтобы исключить объекты, которые больше или меньше, чем один червь. Перейдите в меню Измерения, а затем выберите Измерение суб меню. Это открывает граф / размер вариантов диалоговое окно. Там, установить диапазон области от 28000 до 120000 квадратных микрон. И установить диапазон периметра до 600 до 2500 микрон. Внесите коррективы в эти параметры при использовании червей ненормального размера.

Теперь, завершить процесс отслеживания, нажав Продолжить в диалоговом поле отслеживания. Двойная проверка, что выход треков с фильмом footage. Убедитесь, что каждый червь представлен, если нет четкой причины, чтобы отфильтровать его. Затем, вручную удалить треки, произведенные не червь объектов.

Затем вычислите скорость каждого червя, усредняя пройденное расстояние между каждым кадром или каждой секундой, и создайте среднюю скорость для треков в каждой популяции.