Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- Plaats een transgene worm die GCaMP uitdrukt-- een calcium sensing eiwit-- in een beeldvormingskamer samen met bacterieel voedsel voor de worm. Sluit vervolgens de schaal af met het deksel en de laboratoriumfilm om verdamping te voorkomen. Bekijk het onder een samengestelde microscoop die is uitgerust voor breedveldeppifluorescentie. Registreer timelapsebeelden van de wormen om hun gedrag te volgen en fluorescentie vast te leggen met behulp van beeldvormingssoftware.
Transgene wormen drukken een GCaMP-sensoreiwit uit onder controle van een promotor die de GCaMP-expressie in een specifiek neuron aandrijft. Wanneer dat neuron wordt geactiveerd, vuurt het een actiepotentieel af, dat het plasmamembraan depolariseert. Bij depolarisatie openen spanningsge gated calciumkanalen zich in het plasmamembraan. Dit veroorzaakt een toestroom van calciumionen in de cel, wat resulteert in neuronale excitatie.
GCaMP in het opgewonden neuron bindt de calciumionen. Dit zorgt ervoor dat GCaMP fluoresceert wanneer de wormen worden afgebeeld met een lage intensiteit fluorescentie excitatie licht. In het voorbeeldprotocol zullen we calciumbeeldvorming gebruiken om AVA interneuron activiteit in transgene C. elegans in agarose microchambers te visualiseren.
- Calciumbeeldvorming wordt uitgevoerd op een samengestelde microscoop die is uitgerust voor breedveldocfluorescentie. Om de blootstelling aan licht te beperken, gebruikt u een transistor-transistorlogicasignaal dat een LED activeert om het monster te verlichten op hetzelfde moment dat de camera een frame opneemt.
Voer een burst-film uit gedurende 24 uur die elke worm elke 15 tot 30 minuten in beeld brengt. Neem eerst 20 seconden op met DIC, vervolgens 20 seconden met GFP-fluorescentie en ten slotte een afbeelding van het mKate2-signaal voor besturingsexpressieniveaus.
Gebruik voor visuele gegevensinspectie een valse kleurenkaart om de zichtbaarheid van kleine veranderingen in fluorescentie-intensiteit te verbeteren. Voer ten slotte calciumgegevensanalyse uit met behulp van standaardprocedures.
