Encyclopedia of Experiments: Biology
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- Pour commencer, transférez de jeunes vers adultes sur un tampon d’agarose frais sur une lame. Ajoutez ensuite quelques gouttes de solution levamisole millimolaire pour paralyser les vers. Couvrez les vers d’un glissement et attendez quelques minutes. Placez la glissade sous un microscope confocal à disque filature et concentrez-vous sur la surface extérieure latérale du ver.
L’épiderme d’un ver adulte est une structure mince à une seule couche composée de syncytie multinucléée qui résultent d’événements de fusion cellulaire. La surface apical de l’épiderme sécrète une cuticule collagenelle flexible, tandis que la surface basale est recouverte d’une fine couche de matrice extracellulaire appelée la laminaire basale.
Ensuite, blesser la surface apical de l’épiderme à l’aide d’un laser. Le cytoplasme des cellules endommagées peut s’échapper, apparaissant comme une bulle sur le site de la plaie.
L’irradiation au laser a un avantage sur d’autres techniques, comme la blessure par aiguille, car elle provoque une perturbation localisée de la cuticule et des cellules épidermiques, sans endommager les tissus internes. Dans le protocole d’exemple, nous verrons le processus de blessure au laser chez C. elegans.
- Pour blesser avec précision les nématodes, ce protocole utilise un laser femtoseconde attaché au microscope confocal de disque filature. Les balayages de ligne ou de point utilisant des lasers femtoseconde, tels que ceux dans les microscopes à deux photons, devraient également suffire.
- Commencez par recueillir 10 jeunes adultes sur un tampon d’agar. Paralysez-les dans une goutte de levamisole de 12 millimlaires. Puis couvrez-les d’un bordereau de couverture et attendez quelques minutes pendant qu’ils paralysent.
- Il est essentiel qu’un animal soit complètement paralysé. 12 millimolar levamisole n’affectera pas la réponse de la plaie. Cependant, d’autres méthodes d’immobilisation peuvent également être utilisées.
- Assurez-vous que la puissance laser femtoseconde est réglée à 140 milliwatts, mesurée avant l’objectif, et que le taux de répétition laser est de 80 mégahertz. Maintenant, localisez les vers sous un microscope confocal à disque filature. À l’aide d’un objectif 100x avec une ouverture numérique élevée, concentrez-vous sur l’épiderme syncytial antérieur ou postérieur latéral du ver cible.
En se concentrant sur la surface apique de la cellule épidermique, faire briller le laser pendant deux impulsions de 200 millisecondes séparées par 20 millisecondes. Cela devrait suffire à blesser l’épiderme. Attendez un instant et observez la perturbation locale du cytoplasme, qui apparaîtra comme bouillonnant. Si un marqueur fluorescent est présent, un blanchiment localisé peut être observé.
