Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- Mikroenjeksiyonla ekstrakromomal DNA dizileri oluşturmak-- transgenik solucan suşları oluşturmak için en basit yöntem-- hücre bölünmesi sırasında saptanmayan genetik elementlerle sonuçlanır ve bu nedenle değişken kalıtım oranları ve ifade seviyeleri sergiler. Diziyi bir kromozom içine entegre etmenin amacı bu genetik dengesizliği ve değişkenliği zayıflatmaktır.
Bunu yapmak için, daha önce mikroenjeksiyon tarafından tanıtılan ekstrakromosomal bir dizi taşıyan ve gravid yetişkinlere dönüşmelerini sağlayan L4 transgenik solucanların yaş senkronize popülasyonu ile başlayın. Bu yetişkinleri yeni plakalara aktarın ve her tabakta en az 30 yumurta olana kadar yumurta bırakmalarına izin verin. Yetişkinleri çıkarın ve L4 aşamasına ulaşana kadar yumurtaların büyümesine izin verin. Sonra, solucanları UV ışığıyla ışınlayın. Bu, solucanların DNA onarım makinelerinin diziyi keyfi olarak dahil edebileceği genomik DNA'da rastgele çift iplikçik kırılmalarına neden olur.
Bir gecede iyileşme süresinden sonra, hayatta kalan solucanların sayısını sayın. Ölü solucanların küçük bir yüzdesi verimli ışınlamayı gösterir. Homozygous entegre transgenik çizgileri izole etmek için sonraki nesilleri gözlemleyin. Örnek protokolde, farenkste ifade edilen floresan ko-enjeksiyon işaretleyicisini taşıyan yüksek iletim hızına sahip ekstrakrozomal bir dizi entegre edeceğiz.
- Entegre edilecek transgenik hattın iletim hızını değerlendirin. Her transgenik hat için, floresan stereoskop altında 10 ayrı kültür plakasına 10 floresan gravid yetişkin seçin. Genetik arka planın çoğaltılmasına izin verilen bir sıcaklıkta ayarlanmış bir solucan inkübatöründeki hayvanları kültüre edin.
Ko-enjeksiyon işaretleyicisinin hangi gelişim evresini ifade ettiğini ve en iyi şekilde gözlemlenebileceğini değerlendirmek için her gün soyu izleyin. Floresan stereoscopy kullanarak, floresan soy yüzdesini belirleyerek soyun iletim hızını değerlendirin. Transgene entegrasyonu için, en yüksek iletim oranına sahip transgenik çizgiyi seçin.
Entegrasyon için L4 larva aşamasında senkronize transgenik hayvan popülasyonu elde edin. Beş kültür plakasına 30 floresan gravid yetişkin seçin. Solucanlar 15 santigrat derecede üç ila dört saat yumurta bıraktıktan sonra, plaka ile en az 30 yumurtanın varlığını kontrol edin ve ardından yetişkinleri plakalardan atın.
Hayvanları, soyları L4 larva aşamasına ulaşana kadar bir solucan inkübatöründe kültürlendirin. 15 ila 20 floresan transgenik L4 hayvanı içeren her plakayı kapakları çıkarılmış bir UV çapraz bağlantılayıcıya yerleştirin. Solucanları ışınlayın.
İyileşme için, ışınlanmış solucanları bir gecede 15 santigrat derecede kuluçkaya bırakın. Hayatta olan hayvan sayısını kontrol edin. Elimizde, yaklaşık% 80 ila% 90'lık bir hayatta kalma oranı verimli bir ışınlama için uyarlanabilir. Radyasyona maruz kalan hayvanları, soylar ortak enjeksiyon işaretleyici ifadesinin gözlemlenmesine izin veren gelişim aşamasına ulaşana kadar 15 ila 25 santigrat derecede yetiştirin.
