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JoVE Encyclopedia of Experiments
Encyclopedia of Experiments: Biology

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पूंछ क्लिप से डीएनए निष्कर्षण

 
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पूंछ क्लिप से डीएनए निष्कर्षण: एक विधि ज़ेब्राफ़िश जेनोटाइपिंग में इस्तेमाल किया

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- शोषक कागज के ढेर पर एक एनेस्थेटाइज्ड वयस्क मछली रखकर प्रक्रिया शुरू करें। अब पूंछ फिन को काटने के लिए बाँझ रेजर ब्लेड का उपयोग करें और जल्दी से मछली को वसूली के लिए ताजे पानी वाले टैंक में स्थानांतरित करें। टेल क्लिप को एक साफ ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें लाइसिस बफर होता है। लाइसिस बफर में नॉनियोनिक डिटर्जेंट होते हैं, जो प्लाज्मा झिल्ली और कोशिका की परमाणु झिल्ली को सोलबिलाइज करते हैं बफर में प्रोटीनेज कश्मीर नामक एंजाइम भी होता है जो प्रोटीन को तोड़ता है और डीएनए को लाइसेस में छोड़ने में सक्षम बनाता है । यह नाभिक से डीएनए की रक्षा करने वाले नाभिक को भी नीचा दिखाता है, डीएनए को नाभिक से बचाता है पाचन।

अब, एक इनक्यूबेटर में पूंछ क्लिप के साथ ट्यूबों रात भर छोड़ पूरी तरह से लगातार रोटेशन के साथ ५५ डिग्री सेल्सियस पर ऊतक को तोड़ने के लिए इसके बाद, ट्यूब को 15 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करें प्रोटीन के अपकेंद्रित्र को गोली से निकालने के लिए ट्यूब को गोली से निकाल दें और डीएनए युक्त सुपरनेट को दूसरी ट्यूब में स्थानांतरित करें। एक गोली में डीएनए एकत्र करने के लिए डीएनए और अपकेंद्रित्र को फिर से जमा करने के लिए शराब जोड़ें। निम्नलिखित प्रोटोकॉल में, हम एक जेब्रा वयस्क और मछली की पूंछ क्लिप से डीएनए को अलग करेंगे।

- डीएनए तैयार करने के दिन, 1 मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर की एकाग्रता पर लाइसिस बफर में ताजा प्रोटीन के जोड़ें। ऊतक एक वयस्क मछली से फिन क्लिप या भ्रूणीय मछली का उपयोग करके एकत्र किया जा सकता है।

सबसे पहले, ट्राइकेन समाधान में मछली को एनेस्थेट करें। गिल आंदोलनों की गति धीमी होने तक प्रतीक्षा करें। फिर, मछली को ऊतकों के ढेर पर रखें और बाँझ रेजर ब्लेड के साथ, पूंछ फिन के एक छोटे से टुकड़े को लगभग 2 से 3 मिलीमीटर लंबा काट दें। जल्दी से मछली को वसूली के लिए ताजे पानी के साथ एक लेबल टैंक में रखा।

फिन क्लिप को बाँझ पिपेट टिप के साथ उठाएं और डीएनए लाइसिस बफर के एक सौ माइक्रोलीटर से भरी ट्यूब में स्थानांतरित करें। जानवर के टैंक और ट्यूब दोनों को लेबल करना सुनिश्चित करें। सभी एकत्र ऊतकों को कम से कम चार घंटे तक और रात भर 55 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।

इनक्यूबेशन के बाद 15 मिनट तक 95 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूबों को गर्म करके प्रोटीन के को निष्क्रिय कर दें। इन नमूनों का इस्तेमाल तुरंत पीसीआर के लिए किया जाना चाहिए, लेकिन तीन महीने तक माइनस 20 डिग्री सेल्सियस पर भी स्टोर किया जा सकता है।

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