分层阿加安装：准备活斑马鱼胚胎长期成像与倒显微镜

- 从含有E3介质胚胎的培养皿开始。在麻醉胚胎和苯甲酸酯（PTU溶液）中加入三甲酸酯，以抑制色素形成。在解剖显微镜的帮助下，去角质胚胎。

使用玻璃移液器将一个被分解的胚胎转移到中间有浅玻璃底井的小培养皿中，并去除多余的介质。 接下来，以最佳浓度放置一个藻类溶液，以尽量减少胚胎的失真和动能进入微胶管并加热。将温度降低到 30 摄氏度，以避免因高温而损坏胚胎。

将第一层糖水倒在胚胎上，完全填满浅井。在井上再放置一个盖玻璃，并在上面加1%的糖，第二层将盖玻璃放在原位。

一旦阿加罗斯凝固，填充培养皿与E3介质含有三卡因。这是第三层，并保持阿加罗斯和胚胎水合。在以下协议中，我们将执行斑马鱼胚胎的分层阿加安装，以延长时间推移成像。

- 在安装前，将阿加罗斯溶液加热到65摄氏度，然后让它冷却到大约30摄氏度，这样胚胎就不会受到热量的伤害，并在糖溶液中加入三角星。使用35毫米玻璃底盘，玻璃底数为零盖。用玻璃移液器或微皮带将一个侧面朝向盘子底部轻轻放置一个去矮化的胚胎，然后用微皮带小心地取出剩余的E3。

加 这 第一 琼脂 糖 溶液 自 这 小 井 创建 由 这 盖 玻璃 附加 自 这 底 之 这 菜 自 盖 这 胚胎 制作 确定 那 这 琼脂 糖 涵盖 这 小 井 但 做 不 溢出 它。 盖 这 小 井 跟 这 盖 玻璃 自 创造 一 窄 充满糖分 空间 跟 这 胚胎 之间 这 二 盖 眼镜。 地方 一 层 之 1% 琼脂 糖 溶液 上 返回页首 之 这 盖 玻璃 都 多 这 底 之 这 菜 哪 将 保持 这 盖 玻璃 在 地方 如 它 巩固。 然后 填补 这 剩余 部分 之 这 菜 跟 E3 含 0.02% 三卡因 自 保持 这 系统 水合。 自 识别 这 最佳的 琼脂 糖 浓度 为 层 一 安装 这 胚胎 在 增加 浓度 之 琼脂 糖 和 执行 延时 成像 自 识别 这 浓度 那 最大限度 地 减少 胚胎 失真 和 运动性 然后 测试 一 更好 范围 之 浓度 基于 上 这 结果。

- 本协议最关键的步骤是确定第一层蔗糖的最佳浓度。测试不同纳米浓度的蔗糖，如0.030%，0.032%，等等，以找到最佳浓度。