स्तरित एगर माउंटिंग: एक उल्टे माइक्रोस्कोप के साथ दीर्घकालिक इमेजिंग के लिए लाइव ज़ेब्राफिश भ्रूण तैयार करना

- ई 3 माध्यम में भ्रूण युक्त पेट्री डिश से शुरू करें। पिगमेंट फॉर्मेशन को रोकने के लिए भ्रूण और फिनाइलथिओरिया, पीटीयू सॉल्यूशन को एनेस्थेटाइज करने के लिए ट्राइकेन डालें। एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप की मदद से भ्रूण को डिकोरियोनेट करें।

एक छोटे से पेट्री डिश में एक ग्लास पिपेट का उपयोग करें, जिसमें एक उथले ग्लास बॉटम को अच्छी तरह से केंद्र में रखा जाए और अतिरिक्त माध्यम को हटा दिया जाए। इसके बाद, एक इष्टतम एकाग्रता पर एक उत्पीडिंग समाधान रखें ताकि भ्रूण विरूपण और गतिशीलता को माइक्रोफ्यूज ट्यूब में कम किया जा सके और उसे गर्म किया जा सके। गर्मी के कारण भ्रूण को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए तापमान को 30 डिग्री सेल्सियस तक लाएं।

भ्रूण के ऊपर एगर की पहली परत डालें, पूरी तरह से उथले कुएं को भर दें। एक और कवर ग्लास को कुएं के ऊपर रखें और उसके ऊपर 1% एग्राम जोड़ें। दूसरी परत में कवर ग्लास मौजूद है।

एक बार जब एगरेज़ जम जाता है, तो पेट्री डिश को ट्राइकेन युक्त ई3 माध्यम से भर दें। यह तीसरी परत है और एगर उठे और भ्रूण को हाइड्रेटेड रखती है। निम्नलिखित प्रोटोकॉल में, हम विस्तारित समय चूक इमेजिंग के लिए जेब्राफिश भ्रूण के स्तरित एगर माउंटिंग प्रदर्शन करेंगे।

- बढ़ते से ठीक पहले, एगर उठे समाधान को 65 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें और फिर इसे लगभग 30 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा होने दें ताकि भ्रूण को गर्मी से नुकसान न हो और एगर उठे समाधान में ट्राइकेन जोड़ें। एक नंबर शून्य कवर ग्लास बॉटम के साथ 35 मिलीमीटर ग्लास बॉटम व्यंजन का उपयोग करें। धीरे-धीरे एक डिकेरोनेट भ्रूण को इसके पार्श्व पक्षों में से एक ग्लास पिपेट या माइक्रोपिपेट के साथ पकवान के नीचे की ओर रखें। फिर किसी भी शेष ई3 को माइक्रोपिपेट के साथ ध्यान से हटा दें।

आगे कहना के पहले अगसंर विलयन करने के लिए के मामूली अच्छा बनाया द्वारा के आवरण ग्लास लगाव-युक्त करने के लिए के निम्नतम के के पकवान करने के लिए आवरण के भ्रूण बनाने पक्का उस के अगसंर कवर के मामूली अच्छा लेकिन करता है नहीं ओवरफ़्लो यह। आवरण के मामूली अच्छा साथ के आवरण ग्लास करने के लिए बनाना एक बाल-बाल अगसंरित अंतरिक्ष साथ के भ्रूण के बीच के दो आवरण चश्‍मा। जगह एक तह के 1% अगसंर विलयन पर शीर्ष के के आवरण ग्लास सभी ऊपर के निम्नतम के के पकवान जो मर्जी रखना के आवरण ग्लास में जगह जैसे यह जम जाता है। फिर भरना के शेष भाग के के पकवान साथ E3 युक्त 0.02% ट्राइकेन करने के लिए रखना के प्रणाली हाइड्रेटेड। करने के लिए पहचान के इष्टतम अगसंर एकाग्रता के लिए तह एक कोई पर्वत के भ्रूण में बढ़ाने सांद्रता के अगसंर और प्रदर्शन टाइमलैप्स इमेजिंग करने के लिए पहचान के एकाग्रता उस कम से कम भ्रूण विरूपण और गतिशीलता फिर परीक्षा एक महीन श्रेणी के सांद्रता आधारित पर के परिणाम।

- इस प्रोटोकॉल का सबसे महत्वपूर्ण कदम परत एक के लिए एगर उठे की इष्टतम एकाग्रता की पहचान करना है। इष्टतम एकाग्रता खोजने के लिए 0.030%, 0.032%, एट सेटेरा जैसे एगर उठे की विभिन्न नैनो सांद्रता का परीक्षण करें।