Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- İlgi çekici embriyoları fenil tiyoea içine yerleştirin, PTU, Ringer'ın pigment oluşumunu inhibe etme çözümü, döllenmeden 24 saat sonra başlar. Bu işlem için gerekli olan gelişen anatomiyi daha görünür hale getirir. Trikanin anestezi edilmiş bir embriyoyu görüntüleme odasına aktarın. Üzerine cam bir slayt yerleştirin ve mikroskobunuzun altına görüntüleyin. 488 nanometre lazer altında görülebilen, transgenetik olarak GFP'yi ifade ettiği için yaralanacak aksona odaklanın.
Sitenin önceki bir görüntüsünü alın. Sonra, GFP'nin kırmızı floresan yapmasına neden olan 910 nanometre lazer ile akson görüntüleyin. Çevredeki dokuyu etkilemeden hedef bölgeyi yaralamak için bu lazerin yoğunluğunu artırın.. Bu işleme aksomatomi denir. Dağınık döküntü olarak görünen aksotomiyi doğrulamak için ilk lazerle yeni bir görüntü alın.. Aşağıdaki protokolde zebra balığı embriyolarında iki fotonlu lazer kullanarak periferik duyusal aksonların aksonlarının aksotomisini gerçekleştireceğiz.
- Laboratuvarınızda özel olarak oluşturulmuş iki fotonlu bir kapsam yoksa, Zeiss 510 konfokal iki foton mikroskobu da aksonları kesmek için kullanılabilir. Monte edilen embriyoyu sahneye yerleştirerek ve 25x su hedefi kullanarak odak noktasına getirerek başlıyoruz.
Her iki lazer de GFP'yi tespit etmek için kullanılsa da, iki foton emisyonu kırmızı ve argon lazer emisyonu ikisini ayırt etmek için yeşil ile görselleştirilir.
Argon lazeri kapatın ve iki foton lazerini açın. Aksonun hala odakta olduğundan emin olmak için yaklaşık% 9 iletim yoğunluğunda tarayın. Kırpma aracının kullanılabilir olması için Durdur düğmesine tıklayın. İlgi alanını yakınlaştırmak için Kırp'ı kullanın. Genellikle yaklaşık 70x yakınlaştırırız. Yaralanacak akson bölgesini seçin ve bu bölgeyi odak noktasına getirin. Yakınlaştırma Mod sekmesi altında kontrol edilebilir.
Ardından, Kanallar sekmesinin altında, iki fotonun yoğunluğunu yaklaşık% 9 iletimden% 15 ila% 30 iletime değiştirin. Yeni ayarları etkinleştirmek için Hızlı XY düğmesine tıklayın ve daha sonra fazla hasarı önlemek için Hızlı Durdur'a tıklayın. Prosedür işe yaradıysa akson dağınık enkaz olarak görülmelidir. Son olarak, aksonun gerçekten hasar gördüğünden emin olmak için, 488 nanometre argon lazere geri dönün. Başka bir konfokal görüntü alın ve Z yığınlarının maksimum projeksiyonu oluşturun.
