Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- Legg først en bedøvet fisk med dorsalsiden vendt opp i en for-fuktet svamp. Før elektroporasjon, injiser genetisk materiale i målvevet, i dette tilfellet, en del av forebrain kalt telencephalon. Deretter legger du en liten mengde ultralydgel på hodet. Bruk også gelen på elektrodens spiss for å lette effektiv drift. Plasser den positive elektroden på ventralsiden av hodet og den negative elektroden på dorsalsiden.
Trykk nå elektrodene forsiktig mot hodet og administrer flere pulser av elektrisk strøm. Strømmen skaper midlertidige porer i plasmamembranen til elektroporerte celler og gjør dem gjennomtrengelige. Strømmen letter også bevegelsen av negativt ladede partikler, for eksempel DNA-uttrykksplasmider eller RNAi oligonukleotider tilstede i omgivelsene, inn i cellene. I følgende eksempel vil vi bruke elektroporasjon for å introdusere en rekombinant plasmid i ependymogliale celler, stamceller som er ansvarlige for generering av nye nevroner.
- Dekk fisken telencephalon med en liten mengde ultralydgel. For elektroporasjon av det plasmidinnsprøytede dyret, fjern svampen fra utkasteroppsettet og senk den indre siden av elektrodespissene inn i ultralydgel. Plasser fiskehodet mellom elektrodene, med den positive elektroden på ventralsiden av hodet og den negative elektroden på dorsalsiden. Deretter, mens du fortsatt holder fiskens kropp i svampen, trykker du elektrodene forsiktig og presist mot telencephalon og administrerer strømmen med fotpedalen, holder elektrodene på plass til alle fem pulsene er fullført.
